王慶華，何云，王曉藝（.廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，廣東廣州50006；.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東廣州50006）

復(fù)合抑制劑對(duì)酪氨酸酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響

王慶華1，何云2，王曉藝2
（1.廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東廣州510006）

摘要：采用L-多巴氧化法分別研究了肉桂酸、壬二酸和4-己基間苯二酚兩兩復(fù)合對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制作用。Lineweaver-Burk圖形分析表明，壬二酸和4-己基間苯二酚屬于競(jìng)爭性抑制劑，肉桂酸屬于非競(jìng)爭性抑制劑。兩種競(jìng)爭性抑制劑復(fù)合（壬二酸和4-己基間苯二酚）的直線相交于縱軸上同一點(diǎn)，而一種競(jìng)爭性和一種非競(jìng)爭性抑制劑復(fù)合（肉桂酸和壬二酸、肉桂酸和4-己基間苯二酚）得到的直線相交于第二象限，但不交于同一點(diǎn)。用King-Altman方法推導(dǎo)復(fù)合抑制劑對(duì)酶作用的反應(yīng)速率方程，從理論上分析了上述兩種類型的復(fù)合抑制劑Lineweaver-Burk直線的特點(diǎn)，得出的結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果一致。

關(guān)鍵詞：酪氨酸酶；復(fù)合抑制劑；動(dòng)力學(xué)；壬二酸；4-己基間苯二酚；肉桂酸

酪氨酸酶可逆性抑制劑廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、臨床檢測(cè)、食品加工、環(huán)境監(jiān)測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域[1]，而且越來越多的研究人員從在植物提取物中尋找酪氨酸酶抑制劑[2-4]，在一些研究工作和生產(chǎn)實(shí)踐過程中，往往存在多個(gè)抑制劑同時(shí)作用于酪氨酸酶的情況，如植物提取物、復(fù)方藥物制劑或食品、化妝品的復(fù)合配方中，發(fā)揮功能作用的酶抑制成分常常不局限于一種，還可能涉及兩種甚至多種抑制劑復(fù)合作用[5-10]。若簡單地以粗提取物（混和物）對(duì)酶抑制作用的Lineweaver-Burk圖判定抑制劑的類型，并不能很好地反映多種抑制劑共同作用于同一酶靶點(diǎn)的情況，甚至可能會(huì)得到錯(cuò)誤的結(jié)論。King-Altman方法運(yùn)用圖形輔助來推導(dǎo)復(fù)雜酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程，可簡化推導(dǎo)過程[11]。本文以常見的酪氨酸酶可逆抑制劑肉桂酸、壬二酸、4-己基間苯二酚兩兩混合，從復(fù)合抑制劑對(duì)酶活性抑制試驗(yàn)和酶作用速率方程推導(dǎo)分析兩個(gè)方面，探討兩種可逆抑制劑復(fù)合對(duì)酪氨酸酶二酚酶作用的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。

1　材料和方法

1.1材料

蘑菇酪氨酸酶（845U/mg）：Worthington公司；L-多巴：廣州菲博生物科技有限公司；壬二酸（99%）、肉桂酸（99%）、4-己基間苯二酚（99%）：上海阿拉丁公司；DMSO：sigma公司。

752紫外可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；HH-1型電子恒溫水浴鍋。

1.2方法

1.2.1酪氨酸酶二酚酶活性測(cè)定

在10m L試管中加入1m L L-多巴（1.0mmol/L），3.8mL pH6.8的PBS溶液，充分混勻，于30℃水浴中保溫10min后，加入酶液0.2mL（634U/mL），混勻，測(cè)定反應(yīng)開始2min時(shí)在475 nm處的吸光度A，以吸光值A(chǔ)每分鐘增加0.001為1個(gè)酶活力單位。

1.2.2抑制劑對(duì)酪氨酸酶活性的影響

加入各種不同濃度的抑制劑，保持酶量和反應(yīng)溶液總體積5.0mL不變，按1.2.1方法測(cè)定抑制劑存在下不同底物濃度對(duì)酪氨酸酶二酚酶活性的影響。各種抑制劑均以DMSO溶解后配制，兩種抑制劑復(fù)合的比例是根據(jù)試驗(yàn)測(cè)得的每種抑制劑單獨(dú)作用時(shí)的半抑制率濃度IC50之比確定。

2　結(jié)果

2.1單一抑制劑對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用

肉桂酸、壬二酸、4-己基間苯二酚對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制作用Lineweaver-Burk圖，見圖1。

圖1　單一抑制劑對(duì)酪氨酸酶催化L-多巴活性抑制作用的Lineweaver-Burk曲線Fig.1　Lineweaver-Burk p lots for inhibition on theoxidation of LDOPA by tyrosinase

不同濃度的壬二酸、4-己基間苯二酚的Lineweaver-Burk直線交于縱軸同一點(diǎn)，最大反應(yīng)速率Vmax不變，Km隨抑制劑濃度增大而增大，屬于競(jìng)爭性抑制劑；而不同濃度肉桂酸的Lineweaver-Burk直線交于橫軸同一點(diǎn)，Km值不變，Vmax隨抑制劑濃度增大而減小，是酪氨酸酶二酚酶的非競(jìng)爭性抑制劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往文獻(xiàn)報(bào)道[12-14]一致。

2.2復(fù)合抑制劑對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用

復(fù)合抑制劑對(duì)酪氨酸酶二酚酶作用的Lineweaver-Burk圖，見圖2。

圖2　復(fù)合抑制劑對(duì)酪氨酸酶催化L-多巴活性抑制作用的Lineweaver-Burk曲線Fig.2　Lineweaver-Burk p lots for inhibition of com posite inhibitor on theoxidation of L-DOPA by tyrosinase

一定比例復(fù)合的壬二酸和4-己基間苯二酚復(fù)合抑制劑的Lineweaver-Burk圖的各直線交于縱軸上的同一點(diǎn)，與單一競(jìng)爭性抑制劑的圖形類似，見圖2a′；而肉桂酸與壬二酸、肉桂酸與4-己基間苯二酚分別按一定比例復(fù)合，復(fù)合抑制劑濃度越大，直線斜率越大，不同濃度的復(fù)合抑制劑直線的交點(diǎn)都位于第二象限，不在同一點(diǎn)，見圖2 b′、c′。

3　討論

單一抑制劑的酶抑制動(dòng)力學(xué)Lineweaver-Burk直線都交于同一點(diǎn)：競(jìng)爭性抑制劑交于縱軸，非競(jìng)爭性抑制劑的交于橫軸，混合型抑制劑的交于第二象限。與單一成分抑制劑的Lineweaver-Burk直線交于同一點(diǎn)的情形不同，肉桂酸（非競(jìng)爭性）和壬二酸（競(jìng)爭性）復(fù)合共同作用于酪氨酸酶的Lineweaver-Burk直線都不交于同一點(diǎn)，肉桂酸（非競(jìng)爭性）和4-己基間苯二酚（競(jìng)爭性）復(fù)合共同作用于酪氨酸酶的Lineweaver-Burk直線亦顯示同樣實(shí)驗(yàn)結(jié)果。壬二酸和4-己基間苯二酚是兩種競(jìng)爭性抑制劑復(fù)合，其Lineweaver-Burk圖形與單一競(jìng)爭性抑制劑的類似，各直線都交于縱軸上同一點(diǎn)。在此可推導(dǎo)兩種競(jìng)爭性抑制劑及一種競(jìng)爭性抑制劑和一種非競(jìng)爭性抑制劑復(fù)合作用于同一個(gè)酶的反應(yīng)速度方程，并分別討論這兩種情況的復(fù)合抑制劑動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。

3.1兩種競(jìng)爭性抑制劑復(fù)合對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用

因?yàn)楦?jìng)爭性抑制劑結(jié)合在酶的活性中心，所以兩種競(jìng)爭性抑制劑就不能同時(shí)與酶結(jié)合。圖3為兩種競(jìng)爭性抑制劑共同作用的酶反應(yīng)方程。

圖3　兩種競(jìng)爭性抑制劑共同作用的酶反應(yīng)機(jī)制Fig.3　M echanism of enzym ic catalytic reaction for two com petitive inhibitors

兩種不同的競(jìng)爭性抑制劑I1、I2同時(shí)與酶作用。圖中[S]是底物濃度，[I1]、[I2]是抑制劑濃度，Km為米氏常數(shù)，Ki為抑制劑、或底物、或中間復(fù)合物反應(yīng)平衡常數(shù)，ki為相應(yīng)的反應(yīng)速率常數(shù)。用King-Altman法推導(dǎo)酶反應(yīng)速度方程，其King-Altman圖形見圖4。

圖4　兩種競(jìng)爭性抑制劑復(fù)合作用酪氨酸酶的各種存在形式和k乘積Fig.4　Each enzyme form sand k productof two com petitive inhibitorson tyrosinase

以下是反應(yīng)速率方程的推導(dǎo)過程，式中v代表酶催化反應(yīng)的速率，Vmax是最大反應(yīng)速率。

Lineweaver-Burk方程為：

Lineweaver-Burk圖的縱軸截距1/Vmax不變，表觀Km為

。設(shè)[I]為兩種抑制劑混合的總濃度，[I1]：[I2]=α，則[I]=[I1]+[I2]，[I1]=α[I2]。

表觀Km則等于可看作復(fù)合抑制劑表觀抑制常數(shù)。若KI≤K，可以證明KI≤K.I≤K，

1I21I2即K.I介于KI1和KI2之間。

3.2一種競(jìng)爭性抑制劑I1和一種非競(jìng)爭性抑制劑I2對(duì)酶的抑制作用

I1和I2結(jié)合在酶的不同位點(diǎn)，因此可以同時(shí)與酶結(jié)合，其反應(yīng)式見圖5。

圖5　一種競(jìng)爭性和和一種非競(jìng)爭性抑制劑共同作用的酶反應(yīng)機(jī)制Fig.5　M echan ism of enzym ic catalytic reaction for one competitive inhibitor and onenoncom petitive inhibitor

在用穩(wěn)態(tài)處理時(shí)，推導(dǎo)酶作用速度方程的過程非常復(fù)雜，而用快速平衡態(tài)的處理方法相對(duì)簡單，ES分解為產(chǎn)物P屬慢反應(yīng)，快速達(dá)到平衡時(shí)可忽略。King-Altman矢量圖參考文獻(xiàn)許根俊《酶的作用原理》[11]，略去推導(dǎo)酶促作用速度方程的詳細(xì)過程。

為求不同抑制劑濃度的Lineweaver-Burk圖各直線的交點(diǎn)坐標(biāo)，可列方程組：

由上述推導(dǎo)的兩種抑制劑復(fù)合作用的酶反應(yīng)速率方程分析可知，兩種競(jìng)爭性抑制劑復(fù)合共同作用于酶，與單一競(jìng)爭性抑制劑的圖形一樣，不同抑制劑濃度的酶動(dòng)力學(xué)Lineweaver-Burk直線縱軸截距不變，橫軸截距小于0，交點(diǎn)位于縱軸上的同一點(diǎn)，說明兩種競(jìng)爭性抑制劑復(fù)合作用，不改變酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速率Vmax，但表觀Km值增大，復(fù)合抑制劑表觀介于兩種抑制劑的抑制常數(shù)K.I之間。據(jù)此可以解釋實(shí)驗(yàn)中壬二酸和4-己基間苯二酚復(fù)合對(duì)酪氨酸酶二酚酶作用，與單一競(jìng)爭性抑制劑具有相似的Lineweaver-Burk圖形。一種競(jìng)爭性和抑制非競(jìng)爭性抑制劑復(fù)合，交點(diǎn)橫軸坐標(biāo)1/[S]小于0，縱軸坐標(biāo)1/v大于0，交點(diǎn)位于第二象限，且交點(diǎn)位置與[I1]、[I2]相關(guān)，表觀Km增大，Vmax減小。若I1、I2以一定比例混和，[I]越大，[I1]、[I2]越大，直線斜率越大，不同[I]濃度的一簇直線不交于一點(diǎn)，但各交點(diǎn)都位于第二象限，與單一抑制劑的圖形不一樣，見表1所示。據(jù)此則可解釋實(shí)驗(yàn)中肉桂酸和壬二酸、肉桂酸和4-己基間苯二酚這類由一種非競(jìng)爭和一種競(jìng)爭性抑制劑復(fù)合對(duì)酪氨酸酶作用的Lineweaver-Burk圖形。由此可見，對(duì)于成分復(fù)雜的混合物，單從Lineweaver-Burk圖無法確定究竟是單一成分抑制劑的作用，還是兩種或兩種以上抑制劑的作用。

表1　各種類型抑制劑的Lineweaver-Burk作圖比較Table1　The com parison of Lineweaver-Burk plots for each inhibitor

4　結(jié)論

可逆抑制劑的酶反應(yīng)速度方程推導(dǎo)是基于單一抑制劑成分的作用，所劃分的可逆抑制劑類型，如競(jìng)爭性抑制劑、非競(jìng)爭性抑制劑、反競(jìng)爭性抑制劑和混合型抑制劑，只是對(duì)單一成分抑制劑而言。在研究動(dòng)植物提取物、復(fù)方中藥等對(duì)酶活性抑制作用時(shí)，由于酶抑制成分未知或較為復(fù)雜，不同濃度抑制劑Lineweaver-Burk圖直線的交點(diǎn)有可能不共點(diǎn)。研究者容易忽視這一現(xiàn)象，往往簡單地根據(jù)酶抑制劑作用的Lineweaver-Burk圖直線的交點(diǎn)位置來判定抑制劑的作用類型，而實(shí)際可能是多種抑制成分共同作用的表觀結(jié)果，這個(gè)表觀結(jié)果與混合物中各抑制成分的濃度比例有關(guān)，尤其當(dāng)提取物中含非競(jìng)爭性抑制劑與競(jìng)爭性抑制劑時(shí)，Lineweaver-Burk直線交點(diǎn)在第二象限，不在同一點(diǎn)，若試驗(yàn)中存在測(cè)定誤差，則很容易被認(rèn)為是單一混合型抑制劑類型，這也是在實(shí)際研究中，植物提取物較常被確定為酪氨酸酶混合型抑制劑的可能原因之一。多種抑制劑復(fù)合，具有不同于單一抑制劑的作用特點(diǎn)，抑制劑之間往往具有相互協(xié)同作用的效應(yīng)[15]，其作用機(jī)制值得深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Te-Sheng Chang.An Updated Review of Tyrosinase Inhibitors[J]. Int JMol Sci,2009,10(6):2440-2475

[2]曾鳴,徐良.化妝品用植物提取物美白潛力評(píng)估的研究進(jìn)展[J].日用化學(xué)工業(yè),2013,43(5):382-385

[3]傅國強(qiáng),馬鵬程,吳勤學(xué),等.196味中藥乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用[J].中華皮膚科雜志,2003,36(2):103-106

[4]畢云楓,宋鳳瑞,劉志強(qiáng).天然酪氨酸酶抑制劑的種類及其對(duì)酪氨酸酶抑制作用的研究進(jìn)展[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014,40 (2):454-459

[5]范玉涵,駱從燕,陳文.光甘草定-富勒醇聯(lián)合應(yīng)用對(duì)抑制酪氨酸酶活性和清除DPPH·的協(xié)同作用[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2011, 31(21):1752-1755

[6]宋楊,齊云,劉彬,等.甘草桔梗皂苷對(duì)酪氨酸酶抑制的合并效應(yīng)研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2007,13(3):7-10

[7]徐學(xué)濤,張焜,杜志云,等.西藏紅纓合耳菊提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用[J].中藥材,2008,31(10):1544-1547

[8]鐘佳勝,劉丹,吳小芳,等.庫拉索蘆薈中7種單體化合物對(duì)蘑菇酪氨酸酶活力的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2013,24(2):114-117

[9] 陳學(xué)艷,王艷,李晶,等.12種中藥的水及乙醇提取液對(duì)酪氨酸酶抑制作用的比較[J].天津中醫(yī)藥,2010,27(5):426-427

[10]魏少敏,寧嶺.添加劑復(fù)合的協(xié)同與綜合效應(yīng)原理在療效化妝品開發(fā)中的應(yīng)用[J].日用化學(xué)工業(yè),2000,30(4):37-39

[11]許根俊.酶的作用原理[M].北京:科學(xué)出版社,1983

[12]龔盛昭,楊卓如,程江.肉桂酸抑制酪氨酸酶催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)研究[J].高校化學(xué)工程學(xué)報(bào),2007,21(2):345-349

[13]Bali?a LM,Graupe K.The treatment ofmelasma 20%azelaic acid versus4%hydroquinone cream[J].International Journal ofDermatology,1991,30(12):893-895

[14]王樹棟,羅萬春,高興祥,等.4-己基間苯二酚對(duì)小菜蛾酚氧化酶抑制作用研究[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào),2004,6(3):31-36

[15]王慶華,黃演婷,舒錦華.復(fù)合抑制劑對(duì)酪氨酸酶活性的相互作用研究[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,50(4):91-95

DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.010

收稿日期：2015-03-28

作者簡介：王慶華（1969—），男（瑤），教授，碩士，從事生物活性物質(zhì)研究與開發(fā)。

Effects of Compound Inhibitorson Reaction Kinetics of Tyrosinase

WANGQing-hua1，HEYun2，WANGXiao-yi2
（1.SchoolofBasic Courses，Guangdong PharmaceuticalUniversity，Guangzhou 510006，Guangdong，China；2.Schoolof TraditionalChinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou，510006，Guangdong，China）

Abstract：The inhibitory effects of combinations of cinnamic acid，azelaic acid and 4-hexylresorcinol on the activity of tyrosinase diphenolaseactivitywere studied bymeasuring theoxidation rateof L-dopa.The inhibition kinetics analyzed with Lineweaver-Burk plots demonstrated that azelaic acid and 4-hexylresorcinol were competitive inhibitors，cinnamic acid wasnoncompetitive inhibitor.Lineweaver-Burk plotsof the combinations of two competitive inhibitors（cinnamic Acid and azelaic acid）showed a familyof lineswith a common intercept on the 1/v axis，but the straight lines of the combinations of one competitive inhiitor and one noncompetitive inhibitor（Cinnamic acid and azelaic Acid，Cinnamic acid and 4-hexylresorcinol）showed different intersection points in the second quadrant.The kinetic equation of composite inhibitorwas derived with the King-Altman plotand the characteristic of Lineweaver-Burk plotsof composite inhibitorwasalso analyzed，the experimental resultswere consistentwith theoreticalanalysis.

Keywords：tyrosinase；kinetics；composite inhibitor；azelaic acid；4-hexylresorcinol；cinnamic acid