陸兵，武玉瑩，李志弘，梁鈺婷，王超，黃桂華，梁智群，*（.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530004；2.廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530004）

響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉產(chǎn)α-葡萄糖苷酶發(fā)酵條件

陸兵1，2，武玉瑩1，2，李志弘1，2，梁鈺婷1，2，王超1，黃桂華1，2，梁智群1，2，*
（1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530004；2.廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530004）

摘要：在液體發(fā)酵單因素研究的基礎(chǔ)上，通過二水平設(shè)計(jì)的Plackett-Burman試驗(yàn)確定3個(gè)對黑曲霉產(chǎn)α-葡萄糖苷酶影響的關(guān)鍵因素：玉米淀粉用量、裝液量和溫度。再通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近最大酶活區(qū)。最后利用響應(yīng)面法中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，以期獲得黑曲霉產(chǎn)α-葡萄糖苷酶最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。優(yōu)化結(jié)果表明，黑曲霉產(chǎn)葡萄糖苷酶最優(yōu)條件為：玉米淀粉55.8 g/L，玉米漿干粉30 g/L，接種量4%（體積分?jǐn)?shù)），裝液量49.3mL（500mL搖瓶），搖床轉(zhuǎn)速240 r/min，初始pH4.8，發(fā)酵溫度36.3℃。優(yōu)化后α-葡萄糖苷酶活為375.5U/mL。

關(guān)鍵詞：黑曲霉；α-葡萄糖苷酶；響應(yīng)面法；發(fā)酵條件優(yōu)化

α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC 3.2.1.20）是水解酶類中的一種，屬于水解酶13類31家族[1]。它可以從多糖的非還原末端切開α-1，4糖苷鍵[2]，產(chǎn)生葡萄糖，表現(xiàn)出水解酶活性；同時(shí)，它也可以把游離出來的葡萄糖基轉(zhuǎn)移到另一個(gè)糖上形成α-1，6糖苷鍵[3]，表現(xiàn)出轉(zhuǎn)苷酶活性。

黑曲霉是主要產(chǎn)α-葡萄糖苷酶的菌株之一[4-5]。黑曲霉產(chǎn)生的α-葡萄糖苷酶能將麥芽糖的α-1，4糖苷鍵水解，然后與另一個(gè)麥芽糖形成α-1，6糖苷鍵或分子內(nèi)轉(zhuǎn)苷形成異麥芽糖[6]，從而得到具有特殊生理功能的低聚異麥芽糖。低聚異麥芽糖最明顯的生理功能在于它能促使腸道類有益于人體的微生物菌群生長和相比于其它糖類而言服用者不會產(chǎn)生肥胖和血糖升高[7]。低聚異麥芽糖以它良好的功效，越來越受到人們的青睞，低聚異麥芽糖的銷量也逐年增加，所以低聚異麥芽糖的研究有一個(gè)良好的前景[8]。

制約我國低聚異麥芽糖生產(chǎn)的關(guān)鍵因素是α-葡萄糖苷酶，目前國內(nèi)α-葡萄糖苷酶主要依靠進(jìn)口，造成低聚異麥芽糖成本過高[9]。為了提高α-葡萄糖苷酶的活性，國內(nèi)外很多學(xué)者也進(jìn)行了探討。例如，通過誘變育種選育酶活較高的菌株，基因的克隆與表達(dá)或單因素進(jìn)行培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化[10-13]。通過誘變育種和單因素優(yōu)化發(fā)酵條件，雖然取得了一定的效果，但難以確定培養(yǎng)基組分之間和發(fā)酵條件各因素之間的相互作用關(guān)系[14]。因此，本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法進(jìn)一步深入研究各因素之間的相互作用關(guān)系，從而得到黑曲霉產(chǎn)α-葡萄糖苷酶的最佳發(fā)酵條件。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

實(shí)驗(yàn)室保藏菌種黑曲霉Aspergillusniger J2。

1.1.2試劑

玉米漿干粉：山東康源有限公司；玉米淀粉：山東西王淀粉廠；高溫α-淀粉酶：廣西南寧東恒華道生物；麩皮：中國河北省；葡萄糖等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

METTLERTOLEDOPL303精密電子天平、320 pH計(jì)：德國METTLER公司；SPX-250恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；SKJH-1109超凈工作臺、SKY-211B振蕩培養(yǎng)箱：上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；Uvmini-1240分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.3方法

1.3.1培養(yǎng)基配制

菌種斜面培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖100，麩皮浸汁100，瓊脂18。

孢子培養(yǎng)基（g/L）：麩皮8，水3。

種子培養(yǎng)基（g/L）：麩皮浸汁60，葡萄糖15，pH自然。

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：玉米淀粉60，玉米漿干粉30，pH5.5。

1.3.2培養(yǎng)方法

將菌株接種于菌種斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h后，用已滅菌的生理鹽水溶液沖洗斜面于裝有玻璃珠的三角瓶中，30℃恒溫振蕩2 h，再用脫脂棉過濾，即為孢子懸液。采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整其濃度為106個(gè)/m L。將1 m L孢子懸液接種到種子培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)16 h。將培養(yǎng)16 h后的種子發(fā)酵液體積按2%的接種量接種到50mL產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，34℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

1.3.3α-葡萄糖苷酶酶活測定方法

取粗酶液1mL，加入40℃預(yù)熱的0.2mol/L醋酸緩沖液和2%α-MG溶液各0.5mL，40℃反應(yīng)1 h后，沸水浴滅酶10min。取0.2mL反應(yīng)液，加2mLDNS，沸水浴2min，迅速冷卻，用紫外分光光度計(jì)在550 nm測吸光值。

酶活力定義：在上述條件下，每小時(shí)由底物生成1μg葡萄糖量所需酶量為1U。

1.3.4還原糖的測定

還原糖的測定采用DNS法[15]。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1單因素試驗(yàn)

初始發(fā)酵條件為碳源用量60 g/L，氮源用量30g/L，搖床轉(zhuǎn)速220 r/min，裝液量50mL（500mL搖瓶），pH 5.5，發(fā)酵溫度34℃。通過單因素試驗(yàn)確定最佳發(fā)酵產(chǎn)酶的碳源、氮源、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量、初始pH和發(fā)酵溫度。

1.4.2Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman試驗(yàn)從7個(gè)因素（碳源、氮源、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量、初始pH和發(fā)酵溫度）中篩選出對黑曲霉產(chǎn)葡萄糖苷酶影響顯著的因素。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素水平見表1。

表1　Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素水平Table 1　Factors levelsof the Plackett-Bu rm an design

1.4.3最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)的結(jié)果，給篩選出的顯著因素設(shè)計(jì)一定的步長，其他因素呈正效應(yīng)取高水平，呈負(fù)效應(yīng)取低水平，進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。

1.4.4響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)[16]。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素水平見表2。

表2　響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素和水平Tab le5　Rangeofdifferent factorsinvested in RSM

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1碳源優(yōu)化

各單因素對黑曲霉J2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶酶活的影響見圖1。

由圖1可以看出，在碳源為玉米淀粉，氮源為玉米漿干粉，搖床轉(zhuǎn)速為240 r/min，裝液量為50m L（在500mL搖瓶中），初始pH為4.5，接種量為4%，發(fā)酵溫度為36℃的條件下，黑曲霉J2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶酶活較高，故對各因素水平進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)。

圖1　各單因素對黑曲霉J2產(chǎn)α-葡萄糖苷酶酶活的影響Fig.1　Effectofmedium com position and fermentation conditions on theactivity ofα-glucosidaseby Aspergillusniger J2

2.2Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選顯著影響產(chǎn)酶因子

根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計(jì)原理[17]，選擇7個(gè)因素玉米淀粉、玉米漿干粉、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量、接種量、初始pH和溫度（分別標(biāo)記為A、B、C、D、E、F、G）做二水平設(shè)計(jì)，即高水平（1）和低水平（-1）。依照表3每個(gè)序號所對應(yīng)的試驗(yàn)條件進(jìn)行12組試驗(yàn)，每組試驗(yàn)做3個(gè)平行。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表3所示。

表3　Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab le3　Resultsof Plackett-Burman design

對上述結(jié)果利用Design-Expert8.0分析各因素的主效應(yīng)和重要性。其統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表4所示。

表4　Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果對葡萄糖苷酶活力影響的統(tǒng)計(jì)分析Table 4　Statisticalanalysisof the Plackett-Burman experimental resultsonα-glucosidase

從上表可以看出對黑曲霉產(chǎn)α-葡萄糖苷酶呈正效應(yīng)的是搖床轉(zhuǎn)速、接種量、初始pH和溫度；呈負(fù)效應(yīng)的是玉米淀粉、玉米漿干粉和裝液量。其中玉米淀粉、裝液量和溫度對黑曲霉產(chǎn)α-葡萄糖苷酶影響顯著，可用于進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3最陡爬坡試驗(yàn)

玉米淀粉和裝液量對黑曲霉產(chǎn)α-葡萄糖苷酶呈負(fù)效應(yīng)，故應(yīng)該減少玉米淀粉和裝液量的用量；溫度對黑曲霉產(chǎn)α-葡萄糖苷酶呈正效應(yīng)，因此應(yīng)該提高發(fā)酵溫度。最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表5所示。

表5　最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table5　Steepestascentpath design and results

由以上結(jié)果可知，最大酶活區(qū)在第5組實(shí)驗(yàn)附近，即玉米淀粉60 g/L，裝液量50mL，溫度36℃，故以此發(fā)酵條件為響應(yīng)面的中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.4響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

以對酶活影響顯著的玉米淀粉，裝液量和溫度為自變量，α-葡萄糖苷酶酶活為響應(yīng)值，試驗(yàn)選取17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，做響應(yīng)面回歸分析，得到黑曲霉產(chǎn)α-葡萄糖苷酶的最優(yōu)發(fā)酵條件。響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果表6所示。

表6　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table6　Experimental design and respone of Box-Behnken design

根據(jù)表6的試驗(yàn)結(jié)果，通過Design-Expert8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到回歸方程：

2.4.1響應(yīng)面方差分析

利用軟件Design-Expert8.0對回歸方程進(jìn)行方差分析，其分析結(jié)果如表7所示。

回歸方程方差分析中，由F檢驗(yàn)來判定，概率P值越小，表明其顯著性越高。由表7的結(jié)果可知，模型P＜0.000 1，表明模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.129 9＞0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，即模型擬合性好，模型選擇正確；模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.997 3，即模型有99.73%的機(jī)會解釋酶活產(chǎn)生的原因。X1X2，X2X3對酶活影響顯著，即玉米淀粉與裝液量的交互作用，裝液量與溫度的交互作用對酶活影響顯著。

表7 回歸方程的方差分析Table 7　ANOVA analysis for regression equation

2.4.2響應(yīng)面曲面圖及其等高線圖

圖2　溫度和玉米淀粉對酶活影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.2　Responsesur faceand contour plots for effectof tem perature and corn starch onα-glucosidaseactivity

圖3　溫度和裝液量對酶活影響的相應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.3　Responsesurfaceand contour plots for effectof temperature and liquid volumeonα-glucosidaseactivity

如圖2～圖4所示，它們分別反映了玉米淀粉、裝液量和溫度這3個(gè)因素的兩兩交互作用對酶活的影響。從響應(yīng)曲面圖可以看出，每個(gè)曲面都存在最高點(diǎn)，通過對回歸方程對各個(gè)因素求一階偏導(dǎo)，得到Y(jié)極大值的條件為：X1=-0.208，X2=-0.066，X3=0.125，即在玉米淀粉，裝液量和溫度分別為55.84、49.34g/L，36.25℃存在最大酶活374.7U/mL?？紤]到操作的可行性，確定最佳的培養(yǎng)條件為：玉米淀粉55.8 g/L，玉米漿干粉30 g/L，發(fā)酵溫度36.3℃，接種量4%，裝液量49.3mL，搖床轉(zhuǎn)速240 r/min，初始pH4.8。

圖4　裝液量和玉米淀粉對酶活影響的相應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.4　Responsesur faceand contour plots for effectof liquid volumeand corn starch onα-glucosidaseactivity

2.4.3模型驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型的預(yù)測值，在最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行了3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所測酶活平均為375.5 U/m L，與預(yù)測值374.7U/mL，實(shí)際值與預(yù)測值擬合度為99.79%，證實(shí)該模型有效可靠。

3　結(jié)論

α-葡萄糖苷酶是生產(chǎn)低聚異麥芽糖中的關(guān)鍵酶，所以探求提高α-葡萄糖苷酶的方法與規(guī)律存在著重要意義。本文在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了Plackett-Burman試驗(yàn)，最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，最后得到了最佳的發(fā)酵條件。結(jié)果表明，黑曲霉產(chǎn)葡萄糖苷酶的最優(yōu)發(fā)酵條件為玉米淀粉55.8g/L，玉米漿干粉30g/L，發(fā)酵溫度36.3℃，接種量4%，裝液量49.3m L，搖床轉(zhuǎn)速240 r/min，初始pH4.8。在最優(yōu)的發(fā)酵條件下，葡萄糖苷酶最大酶活達(dá)375.5U/mL。

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DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.042

收稿日期：2014-05-18

基金項(xiàng)目：國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2006AA10Z339）；國家自然科學(xué)地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（20362001）

作者簡介：陸兵（1988—），男（漢），碩士研究生，研究方向：微生物工程。

*通信作者：梁智群（1959—），男，教授，博士，研究方向：食品微生物。

Optim ization of Fermentation Conditions forα-glucosidase Production by Aspergillus Niger Using Response Sur face M ethodology

LUBing1，2，WU Yu-ying1，2，LIZhi-hong1，2，LIANG Yu-ting1，2，WANGChao1，HUANGGui-hua1，2，LIANGZhi-qun1，2，*
（1.Collegeof Life Science and Technology，GuangxiUniversity，Nanning 530004，Guangxi，China；2.State Key Laboratory forConservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，GuangxiUniversity，Nanning 530004，Guangxi，China）

Abstract：According to the results of single experiment，three key factors influencing theα-glucosidase production in Aspergillusniger fermentationwere determined by two level factorial design of Plackett-Burman experiment.Then thebestoptimal regionswere approached by the steepestascentpath experiment.Finally，the Box-Behnken experiment design in the response surfacemethodswas used in order to optimize fermentation medium and conditions.The resultsshowed thatoptimal fermentation conditionswere corn starch 55.8 g/L，corn steep powder 30 g/L，inoculum 4%（volume fraction），shaking speed 240 r/min，initial pH 4.8，49.3 mL liquid volume in 500 mL triangular flask and temperature 36.3℃.Under the optimal condition，the enzyme activity ofα-glucosidasewas375.5U/mL.

Keywords：Aspergillusniger；α-glucosidase；responsesurfacemethodology（RMS）；fermentation optimization