王 頔，秦 臻，周黨俠，張海峰

(1.西安交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)部 病理學(xué)系，陜西 西安710061；2.陜西省婦幼保健院 生殖中心，陜西 西安710003)

?

M3受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)大鼠腮腺細(xì)胞內(nèi)AQP5和脂質(zhì)筏的核轉(zhuǎn)位

王 頔1*，秦 臻1,2，周黨俠1，張海峰1

(1.西安交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)部 病理學(xué)系，陜西 西安710061；2.陜西省婦幼保健院 生殖中心，陜西 西安710003)

水通道蛋白5(aquaporin, AQP5)存在于唾液腺腺泡細(xì)胞內(nèi)，對(duì)調(diào)節(jié)水分轉(zhuǎn)運(yùn)速率和維持唾液分泌具有重要作用，AQP5功能失調(diào)會(huì)導(dǎo)致如增齡性口干、頭面部放療口干癥、SS綜合征和糖尿病口腔干燥等相關(guān)疾病的發(fā)生[1]。研究表明，M3毒蕈堿乙酰膽堿受體(M3 muscarinic acetylcholine receptor, M3-mAChR)激動(dòng)劑西維美林(cevimeline)可以誘導(dǎo)AQP5與脂質(zhì)筏(lipid raft)從胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)移至細(xì)胞頂膜(管腔側(cè)細(xì)胞膜)，通過增加膜上蛋白的數(shù)量而快速調(diào)節(jié)對(duì)水的通透性[2]。本研究是明確M3-mAChR活化后，AQP5是否與脂質(zhì)筏首先轉(zhuǎn)位至細(xì)胞系。

1 材料與方法

1.1 材料：SPF級(jí)8周齡雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～210 g，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第08005號(hào))。兔抗AQP5和羊抗flotillin- 2抗體(Santa Cruz公司)，兔抗GM1抗體(Calbiochem- Novabiochem公司)，羊抗兔Alexa- 488、雞抗羊Alexa- 594熒光二抗和封閉用的正常血清(北京中杉金橋生物公司)。

1.2 免疫熒光雙標(biāo)：大鼠隨機(jī)分為6組(n=5)：對(duì)照組及西維美林注射后1.5、3、6、10和60 min不同時(shí)間點(diǎn)處死組。經(jīng)大鼠尾靜脈按5.0 mg/kg注射西維美林，腮腺組織冷凍包埋。7 μm冰凍切片冷乙醇固定30 min后。分別滴加兔抗AQP5(1∶1 000稀釋)和羊抗flotillin- 2(1∶500稀釋)一抗，4 ℃過夜。PBS振洗后，再加入1∶500稀釋的羊抗兔Alexa- 488和雞抗羊Alexa- 594熒光二抗避光1h。50 g/L的PI孵育1 h染細(xì)胞系。無熒光緩沖甘油封片后，激光共聚焦顯微鏡照相分析。以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 腮腺細(xì)胞細(xì)胞系的分離：大鼠尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液或者西維美林3 min后，取腮腺組織至0.32 mol/L的蔗糖緩沖液中，600 ×g離心10 min。沉淀清洗兩次后懸浮，調(diào)節(jié)懸液濃度至1.89 mol/L，置于離心管2.2 mol/L蔗糖緩沖液上，75 000 ×g離心90 min，得到細(xì)胞系沉淀。

1.4 去垢劑可溶和不溶片段的制備：細(xì)胞系溶解在包括1% TX- 100的TNE緩沖液中(25 mmol/L Tris-HCl[pH 7.4],150 mmol/L NaCl, 5 mmol/L EDTA)，冰上放置30 min。4 ℃ 200 000 ×g離心30 min，分離去垢劑可溶和不可溶片斷。

1.5 Western印跡：細(xì)胞系和去垢劑可溶及不溶成分在12.5% SDS-PAGE凝膠中電泳，待樣品分離后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，13 V轉(zhuǎn)膜25 min。5%牛血清白蛋白封閉1 h，分別與抗AQP5和GM1抗體(1∶1 500)孵育1 h，TBST洗膜3次。二抗(1∶4 000)孵育1h后，洗膜，ECL顯色。β-actin為內(nèi)參照計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 西維美林誘導(dǎo)AQP5向細(xì)胞系和細(xì)胞頂膜的運(yùn)輸：靜息狀態(tài)下，AQP5彌漫分布在胞質(zhì)和細(xì)胞頂膜；西維美林注射1.5～3 min后，AQP5定位在細(xì)胞系；6～10 min后，AQP5主要定位在細(xì)胞頂膜，60 min后，AQP5在細(xì)胞頂膜的水平下降，彌散入胞質(zhì)(圖1)。

2.2 AQP5和脂筏運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞系和細(xì)胞頂膜：靜息條件下，AQP5和脂質(zhì)筏的標(biāo)志物脂筏結(jié)構(gòu)蛋白2(flotillin2)共定位在胞質(zhì)和細(xì)胞頂膜，西維美林注射3 min后，AQP5和脂筏結(jié)構(gòu)蛋白2出現(xiàn)在細(xì)胞系內(nèi)和細(xì)胞頂膜，60 min后AQP5和脂質(zhì)筏從胞核消失，重新回到胞質(zhì)(圖2)。西維美林注射3 min后，AQP5和脂質(zhì)筏的另一標(biāo)志物GM1在細(xì)胞系內(nèi)的水平明顯上升(P<0.05)(圖3A)。AQP5在無刺激條件下，主要呈現(xiàn)在細(xì)胞系去垢劑不溶片段內(nèi)，西維美林作用后，細(xì)胞系內(nèi)的AQP5在去垢劑可溶和不溶成分內(nèi)均增加(P<0.05)，而GM1的水平僅在去垢劑不溶的片段內(nèi)增加(P<0.05)(圖3B)。

A.control group; B～F.1.5,3,6,10 and 60 min after cevimeline-injection; arrow shows AQP5 in the nuclei 圖1 免疫熒光檢測西維美林注射后腮腺組織內(nèi)AQP5的變化

A.overlap of AQP5(Alexa- 488, green) and flotillin- 2(Alexa- 594, red); B.magnification of A; C.higher magnification of B; arrows shows AQP5 in the nuclei

3 討論

AQP5是一種細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對(duì)調(diào)節(jié)水分轉(zhuǎn)運(yùn)速率和維持唾液分泌具有重要作用，定向的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)是確保其發(fā)揮生理功能的重要調(diào)節(jié)方式。脂質(zhì)筏是膜脂雙層內(nèi)含有特殊脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的微區(qū)域，4℃時(shí)不溶于非離子去垢劑Triton X- 100，涉及信號(hào)傳導(dǎo)，蛋白分選和運(yùn)輸?shù)燃?xì)胞活動(dòng)。已有研究表明，西維美林可以誘導(dǎo)AQP5和脂質(zhì)筏從胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)移至細(xì)胞頂膜，快速調(diào)節(jié)對(duì)水的通透性[2]。

*P<0.05 compared with control group圖3 AQP5和GM1在細(xì)胞系內(nèi)的分布Fig 3 Distribution of AQP5 and GM1 in isolated nuclei

本研究結(jié)果顯示，西維美林刺激后1.5～3 min內(nèi)，AQP5出現(xiàn)在細(xì)胞系內(nèi)，并且和脂質(zhì)筏共定位，6～10 min后，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞頂膜，之后逐漸內(nèi)化入胞質(zhì)。說明AQP5和脂質(zhì)筏在刺激狀態(tài)下首先轉(zhuǎn)位至細(xì)胞系，接著移動(dòng)到細(xì)胞頂膜。西維美林刺激后，分離的腮腺細(xì)胞系內(nèi)AQP5和脂質(zhì)筏特異標(biāo)志物GM1水平明顯上升，且都主要出現(xiàn)在去垢劑不溶的片段內(nèi)，去垢劑可溶片段內(nèi)AQP5含量雖然在刺激后有所升高，但是明顯低于不溶片段。提示AQP5主要定位于去垢劑不溶的脂質(zhì)筏內(nèi)，并受其調(diào)節(jié)共同從核外轉(zhuǎn)移至核內(nèi)。已知氯離子通道蛋白27(NCC27)出現(xiàn)在細(xì)胞系內(nèi)，調(diào)節(jié)氯離子在核膜上的進(jìn)出[3]。有關(guān)AQP5迅速轉(zhuǎn)位至細(xì)胞系的作用及是否涉及細(xì)胞系內(nèi)水的轉(zhuǎn)運(yùn)和DNA合成等過程，還有待深入研究。

[1] Delporte C. Aquaporins in salivary glands and pancreas[J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1840: 1524- 1532.

[2] Wang D, Yuan Z, Inoue N,etal. Abnormal subcellular localization of AQP5 and downregulated AQP5 protein in parotid glands of streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Biochim Biophys Acta, 2011, 1810: 543- 554.

[3] Valenzuela SM, Mazzanti M, Tonini R,etal. The nuclear chloride ion channel NCC27 is involved in regulation of the cell cycle[J]. J Physiol, 2000, 529：541- 552.

2014- 05- 12

：2014- 06- 22

西安交通大學(xué)新教師科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)(DWYXc111000127)

*通信作者(correspondingauthor)：wangdi2011@mail.xjtu.edu.cn

1001-6325(2015)02-0237-03

R 333.1

：A