孔祥權(quán)，睢 燕，蔣靜涵*，許守明，章 輝

(皖南醫(yī)學(xué)院 第一附屬醫(yī)院 1.急診內(nèi)科； 2.兒科, 安徽 蕪湖 241001)

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Intermedin1-53抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞合成膠原

孔祥權(quán)1，睢 燕2，蔣靜涵1*，許守明1，章 輝1

(皖南醫(yī)學(xué)院 第一附屬醫(yī)院 1.急診內(nèi)科； 2.兒科, 安徽 蕪湖 241001)

目的探討IMD1-53對(duì)血管緊張素Ⅱ (AngⅡ) 誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞膠原代謝的調(diào)節(jié)作用。方法培養(yǎng)新生SD大鼠心肌成纖維細(xì)胞，將其分成對(duì)照組、AngⅡ+不同濃度IMD1-53組。Westem blot法檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)。SYBR GreenⅠ熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)IMD1-53受體樣受體(CRLR)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)mRNA表達(dá)。結(jié)果IMD1-53呈劑量依賴性抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞合成Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白(P<0.01，P<0.05)。IMD1-53呈劑量依賴抑制成纖維細(xì)胞TGF-β表達(dá) (P<0.05)。結(jié)論IMD1-53抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞膠原的合成，下調(diào)TGF-β表達(dá)，可能與IMD1-53抗心肌纖維化作用有關(guān)。

Intermedin1-53；心肌成纖維細(xì)胞；血管緊張素Ⅱ；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β

心肌纖維化是導(dǎo)致心功能不全、心律失常及慢性心衰難以逆轉(zhuǎn)的最主要病理?yè)p傷之一。用系統(tǒng)進(jìn)化分析法發(fā)現(xiàn)了CGRP超家族的一個(gè)新成員Intermedin(IMD)[1]， 又進(jìn)一步證實(shí)IMD表達(dá)于人體心肌細(xì)胞、冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和下丘腦視上核等組織器官內(nèi)[2]。IMD具有強(qiáng)大的心血管保護(hù)作用，還有擴(kuò)張腎血管、促進(jìn)尿鈉排泄和利尿的作用,也具有抗凋亡、抗纖維化和抗增殖的作用。本實(shí)驗(yàn)觀察Intermedin1-53(IMD1-53)對(duì)血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞膠原合成的影響，論證IMD1-53是體內(nèi)重要抗纖維化因子，為心肌纖維化的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

清潔級(jí)出生1～4 d的雄性SD乳鼠[皖南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(浙) 201200047]。合成的大鼠IMD1-53(Phoenix Pharmaceutical 公司)；AngⅡ、Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白單克隆抗體(Abcam公司)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒與SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒、 CRLR和TGF-β及內(nèi)參照GAPDH特異反轉(zhuǎn)錄及PCR引物(Promega公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

將實(shí)驗(yàn)分為5組，即 1)對(duì)照組； 2)AngⅡ刺激組：加入1×10-6mmol/L的AngⅡ；3)IMD1-53低、中、高劑量組：加入1×10-6mmol/L AngⅡ的同時(shí)分別加入1×10-9、1×10-8和1×10-7mmol/L IMD1-53。

1.3 心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白的檢測(cè)

用Western blot法檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白含量，將培養(yǎng)的第2代心肌成纖維細(xì)胞接種在24孔培養(yǎng)板上，調(diào)整同步化后裂解細(xì)胞，裂解液離心,收集上清液, BCA法定量蛋白, SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后將凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜及Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白印跡雜交。掃描條帶吸光度值(A值),實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)與對(duì)照組相比取值,經(jīng)自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。

1.4心肌成纖維細(xì)胞IMD受體樣受體(calcitoninreceptor-likereceptor，CRLR)和TGF-β的檢測(cè)

SYBR GreenⅠ熒光實(shí)時(shí)定量PCR(real time quantitative polymerase chain reaction, RQ-PCR) 檢測(cè)CRLR和TGF-β表達(dá)。以GAPDH內(nèi)參照，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行歸一化處理。采用相對(duì)定量法，樣品目的基因的相對(duì)定量(relative quantification，RQ) 用2-ΔΔCt計(jì)算。每份標(biāo)本至少重復(fù)檢測(cè)3 次。應(yīng)用ABI7000熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增及檢測(cè)，所有的PCR產(chǎn)物均經(jīng)熔解曲線分析以分辨目的產(chǎn)物與非特異產(chǎn)物以及引物二聚體, 并且再經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)。CRLR引物的正、反向序列分別為5′-CAACTGCTGGATCAGCTCAG-3′和5′-CATCGCTGATTGTTGACACC-3′。TGF-β引物的正、反向序列分別為5′-CCAAGGAGACGGAATACAG G-3′和5′-GTGTTGGTTGTAGAGGGCAAG-3′。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1IMD1-53對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成的影響

與對(duì)照組比較，心肌成纖維細(xì)胞在AngⅡ的作用下Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白含量明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。1×10-9、1×10-8和1×10-7mmol/L IMD1-53呈濃度依賴性地抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成(P<0.01，P<0.05) (圖1)。

*P<0.01 compared with control; #P<0.05 compared with AngⅡ圖1 心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ和Ⅲ膠原蛋白表達(dá)Fig 1 Expression of collagenⅠ and Ⅲ in cardiac

2.2IMD1-53對(duì)TGF-βmRNA表達(dá)的影響

AngⅡ顯著刺激TGF-β mRNA表達(dá)(P<0.01)，與AngⅡ組相比，IMD1-53抑制由AngⅡ刺激的TGF-β mRNA表達(dá)。不同濃度IMD1-53間TGF-β mRNA表達(dá)也存在明顯差異(P<0.05)(表1)。

2.3IMD1-53對(duì)CRLRmRNA表達(dá)的影響

在新鮮心肌成纖維細(xì)胞上可以檢測(cè)到CRLR mRNA表達(dá)，隨著傳代次數(shù)的增加CRLR mRNA表達(dá)逐漸下調(diào)。AngⅡ抑制CRLR mRNA表達(dá)(P<0.05)，且這種抑制作用不能被外源性IMD1-53所逆轉(zhuǎn)(表1)。

表1 心肌成纖維細(xì)胞TGF-β 和CRLR mRNA表達(dá)

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with AngⅡ.

3 討論

IMD在體內(nèi)的作用很多，對(duì)心血管系統(tǒng)的作用尤為明顯，主要表現(xiàn)在舒張血管和降低血壓[3]； 對(duì)缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡具有一定保護(hù)作用[4]；能增加離體大鼠的冠脈流量并增加心肌收縮力[5];調(diào)節(jié)新生大鼠肥大心肌細(xì)胞[6]。當(dāng)心肌遭受病理因素刺激后，它們開(kāi)始增殖并分化為成纖維細(xì)胞，分泌大量膠原促使心肌細(xì)胞肥大和纖維化。心肌發(fā)生病變時(shí)，體內(nèi)分泌大量TGF-β、血管緊張素Ⅱ和內(nèi)皮素1等物質(zhì)，這些物質(zhì)直接刺激成纖維細(xì)胞活化和膠原的產(chǎn)生[7]。

AngⅡ能抑制心肌細(xì)胞合成與分泌IMD1-53，外源性IMD1-53可明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞活化，且這種抑制作用與IMD1-53劑量依賴性增加細(xì)胞內(nèi)cAMP 水平有關(guān)[8]。在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷模型上觀察到IMD1-53改善異丙腎上腺素所造成的大鼠心肌損傷，增強(qiáng)心臟功能，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這種保護(hù)作用可能是通過(guò)cAMP途徑和抗氧自由基生成途徑實(shí)現(xiàn)的[9]。本研究顯示IMD1-53能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化，主要是抑制成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成，且這種抑制效應(yīng)隨IMD1-53劑量的增加更明顯。

TGF-β 是新近發(fā)現(xiàn)的一組調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的TGF-β超家族。具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)和抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解等生理功能。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TGF-β的基因表達(dá)隨著IMD1-53劑量的增加逐漸下降，提示IMD1-53的抗纖維化作用可能是通過(guò)抑制AngⅡ誘導(dǎo)的TGF-β表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，而IMD受體樣受體的表達(dá)未發(fā)生明顯變化，說(shuō)明IMD1-53抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌纖維化作用可能不依耐受體數(shù)量的變化。

綜上所述， IMD1-53可呈濃度依賴性地抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞合成膠原，下調(diào)TGF-β表達(dá)可能是其抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌纖維化機(jī)制之一。IMD極有可能是一種新的內(nèi)源性抗心肌纖維化物質(zhì)，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

[1] Roh J, Chang CL, Bhalla A,etal. Intermedin is a calcitonin/ calcitonin gene-related pept ide family peptide acting through the calcitonin receptor-like receptor / receptor activity-modifying protein recept or complexes[J]. J Biol Chem, 2004, 279: 7264- 7274.

[2] Morimoto R, Satoh F, Murakami O,etal.Expression of adrenomedullin 2/intermedin in human brain, heart, and kidney[J].Peptides, 2007, 28: 1095- 1103.

[3] Yang JH, Qi YF, Jia YX,etal. Protective effects of intermedin/adrenomedullin on ischemia /reperfusion injury in isolated rat hearts[J]. Peptides, 2005, 26: 501- 507.

[4] Song JQ, Teng X, Cai Y,etal. Activation of Akt/GSK- 3β signaling pathway is involved in intermedin1-53protection against myocardial apoptosis induced by ischemia /reperfusion[J]. Apoptosis，2009, 14: 1299- 1307.

[5] Yang JH, Jia YX, Pan CS,etal. Effects of intermedin1-53on cardiac function and ischemia /reperfusion injury in isolated rat hearts[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 327: 713- 719.

[6] Yang JH, Ma CG, Cai Y,etal. Effect of intermedin1-53on Angiotensin Ⅱ-induced hypertrophy in neonatal rat ventricular myocytes[J]. Cardiovasc Pharmacol, 2010, 56: 45- 52.

[7] Bouzegrhane F, Thibault G. Is angiotensin Ⅱ a proliferative factor of cardiac fibroblasts?[J]. Cardiovasc Res, 2002, 53: 304- 312.

[8] Yang JH, Cai Y, Duan XH,etal. Intermedin1-53inhibits rat cardiac fibroblast activation induced by angiotensin Ⅱ[J]. Regulatory Peptides, 2009, 158: 19- 25.

[9] Jia YX. Intermedin1-53protects the heart against iso- proterenol induced ischemic injuty in rats[J]. Eur J Pharmacol, 2006, 549: 117- 123.

新聞點(diǎn)擊

利用干細(xì)胞培養(yǎng)人類(lèi)心臟組織

據(jù)英國(guó)《BBC新聞》(BBC NEWS)2013年8月14日?qǐng)?bào)道，科學(xué)家利用干細(xì)胞，培養(yǎng)出能在培養(yǎng)皿上自發(fā)收縮的人類(lèi)心臟組織，意味在制造移植器官方面取得進(jìn)展。

美國(guó)賓州匹茲堡大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)利用取自人類(lèi)皮膚細(xì)胞得出的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS)，制作出名為MCPs的心臟前體細(xì)胞。

研究人員先移取一些老鼠心臟細(xì)胞，利用此方式制作出來(lái)的原始心臟細(xì)胞，附著在小鼠心臟支架上。

這種心臟支架是由蛋白質(zhì)和碳水化合物構(gòu)成的無(wú)生命組織網(wǎng)絡(luò)，細(xì)胞可附著其上生長(zhǎng)。

匹茲堡大學(xué)發(fā)表聲明說(shuō)，心臟前體細(xì)胞附著在此3D支架上，成長(zhǎng)并發(fā)育成心臟肌肉，歷經(jīng)20 d血液供應(yīng)后，此重建小鼠器官再度以40～50次/min開(kāi)始收縮。

匹茲堡大學(xué)資深研究員楊雷(Lei Yang)認(rèn)為：“距離制作出整個(gè)人類(lèi)心臟，還很遙遠(yuǎn)，但我們?yōu)閷?lái)的心臟組織工程提供新途徑的細(xì)胞來(lái)源。我們希望未來(lái)的研究將會(huì)用來(lái)取代患者因心臟病發(fā)作受損的部分組織，或者整個(gè)心臟器官?！?/p>

該研究刊登于《自然通訊》(Nature Communication)期刊。

飛行員職業(yè)腦損傷嚴(yán)重

據(jù)英國(guó)《BBC新聞》(BBC NEWS)2013年8月20日?qǐng)?bào)道，美國(guó)公布的研究報(bào)告稱，在高空飛行的美國(guó)空軍飛行員，相較非飛行員，受到微小腦部損傷的情況非常普遍。

報(bào)告分析曾駕駛U-2偵察機(jī)在約21 000米高空飛行的102名飛行員，這些飛行員年齡26～50歲，腦部損傷是非飛行員的3倍左右。報(bào)告指出，不管飛行員是否出現(xiàn)減壓癥(decompression sickness)，腦部都有受損跡象。

非飛行員腦部損傷與年齡老化有關(guān)，主要發(fā)生在前額葉白質(zhì)，但高空飛行的飛行員受損部位是整個(gè)腦組織。

德克薩斯州大學(xué)和美國(guó)空軍航空醫(yī)學(xué)院神經(jīng)學(xué)家，研究報(bào)告作者麥蓋爾(Stephen McGuire)說(shuō)：“空軍飛行員罹患減壓癥風(fēng)險(xiǎn)自2006年以來(lái)增加2倍，這可能跟更頻繁和更長(zhǎng)時(shí)間飛行有關(guān)。”

他說(shuō)：“但截至目前，醫(yī)學(xué)界尚無(wú)法驗(yàn)證這樣的傷害是否會(huì)造成永久性神經(jīng)認(rèn)知問(wèn)題或記憶衰退。”

人體周?chē)h(huán)境壓力急速改變，導(dǎo)致血液中產(chǎn)生氮?dú)鈿馀荩銜?huì)造成減壓癥。潛水員、飛行員和登山者都是減壓癥高危人群。

該研究報(bào)告刊登于《神經(jīng)學(xué)》(Neurology)期刊。

Intermedin1-53inhibits collagen synthesis induced by angiotensinⅡin cadiac fibroblasts of rats

KONG Xiang-quan1, SUI Yan2, JIANG Jing-han1*, XU Shou-ming1, ZHANG Hui1

(1.Dept. of Emergency Medicine; 2.Dept. of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of Wannan Medical College, Wuhu 241001, China)

ObjectiveTo investigate collagen metabolism modulation of Intermedin1-53(IMD1-53) on angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ)-induced rat cardiac fibroblasts.MethodsSD neonatal rat cardiac fibroblasts were cultured and divided them into control group, AngⅡ + different concentrations IMD1-53groups.Ⅰ and Ⅲ collagen expression in cardiac fibroblasts were measured by Westem blot, IMD1-53receptor-like receptor (calcitonin receptor-like receptor, CRLR) and transforming growth factor-β (TGF-β) mRNA expression were exammed by real-time PCR.ResultsIMD1-53significantly inhibited AngⅡ-induced collagen synthesis in cardiac fibroblasts, and this effect was more obvious with the increase of IMD1-53(P< 0.01，P<0.05). Similar phenomenon was recorded in TGF-β expression in cardiac fibroblasts(P<0.05).ConclusionsIMD1-53inhibited collagen synthetic in cardiac fibrosis induced by AngⅡ, down-regulated TGF-β expression. These may relate to IMD1-53anti myocardial fibrosis.

Intermedin1-53; cardiac fibroblast; angiotensin Ⅱ; transforming growth factor-β

2014- 07- 03

：2014- 10- 23

安徽省教育廳自然科學(xué)基金(KJ2013Z334)；皖南醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)科研培育項(xiàng)目(WK2014ZF02)

*通信作者(correspondingauthor)：13905532295@163.com

1001-6325(2015)02-0187-04

研究論文

R 331.3

：A