劉志歡，王義兵，王共先,2，黃 亮，郎 斌，許曉源，傅 斌,2*

(1.南昌大學 第一附屬醫(yī)院 泌尿外科, 江西 南昌 330006；2.江西省泌尿外科研究所， 江西 南昌 330006；3.澳門理工學院 高等衛(wèi)生學校，澳門 999078；4.九江學院 基礎醫(yī)學院 江西省生物醫(yī)藥重點實驗室，江西 九江 332000)

?

研究論文

Notch信號通路調控上皮-間質轉化影響膀胱癌侵襲性和耐藥性

劉志歡1，王義兵1，王共先1,2，黃 亮1，郎 斌3，許曉源4，傅 斌1,2*

(1.南昌大學 第一附屬醫(yī)院 泌尿外科, 江西 南昌 330006；2.江西省泌尿外科研究所， 江西 南昌 330006；3.澳門理工學院 高等衛(wèi)生學校，澳門 999078；4.九江學院 基礎醫(yī)學院 江西省生物醫(yī)藥重點實驗室，江西 九江 332000)

目的體外探討Notch信號通路對膀胱癌細胞侵襲性與耐藥性的影響及分子機制。方法采用Notch信號通路受體完全阻斷劑(γ分泌酶抑制劑)處理膀胱癌T24、5637和J82細胞48 h后，倒置顯微鏡觀察膀胱癌細胞增生及形態(tài)；用RT-PCR和Western blot在mRNA和蛋白水平檢測上皮-間質轉化(EMT)分子標志物E-cadherin、N-cadherin、vimentin和Alpha-smooth muscle actin的表達；MTT、Transwell檢測膀胱癌細胞耐藥性及侵襲能力。結果完全阻斷Notch信號通路后，鏡下顯示膀胱癌細胞形態(tài)變小，細胞分散；EMT分子標志物E-cadherin mRNA和蛋白水平表達上調(P<0.05)，N-cadherin、vimentin、Alpha-smooth muscle actin mRNA和蛋白水平表達下調(P<0.05)；膀胱癌細胞T24、5637和J82增殖明顯被抑制(P<0.05)；膀胱癌細胞T24、5637和J82穿過微孔膜的細胞數(shù)明顯減少(P<0.05)。結論Notch信號通路可通過調控EMT的變化而改變膀胱癌的侵襲性與耐藥性。

膀胱癌；Notch信號通路；上皮-間質轉化；γ分泌酶抑制劑

膀胱癌是泌尿系最常見的惡性腫瘤，其生物學特點是容易復發(fā)、侵襲和轉移，目前對膀胱癌侵襲和轉移機制尚未明確[1]。然而近些年對上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)的研究使人們對癌癥的轉移和侵襲有了進一步認識[2- 4]。EMT是指上皮細胞在特定的環(huán)境下與基底膜相互作用，逐漸轉化為具有間質表型特征細胞的生物學過程。EMT使細胞失去極性，癌細胞由此獲得高遷移、侵襲、抗凋亡及降解細胞外基質等間質表型特征細胞的能力。在前期的研究中，發(fā)現(xiàn)Notch信號通路在淺表性膀胱腫瘤中可能起抑制腫瘤作用，表現(xiàn)為Notch1和Jagged- 1在膀胱癌組織中的表達明顯低于正常膀胱黏膜，而在侵襲性膀胱癌中的Notch1和Jagged- 1的表達卻明顯高于淺表性膀胱腫瘤。據(jù)此可推測Notch信號通路可能與膀胱癌的侵襲與轉移有關，其內(nèi)在機制不明。本實驗利用γ分泌酶抑制劑完全阻斷Notch信號通路后，探討膀胱癌T24，5637和J82細胞形態(tài)學、耐藥性、侵襲能力的變化，通過觀察EMT分子標志物的改變，進而驗證Notch信號通路是否通過改變EMT而影響膀胱癌的侵襲性與耐藥性。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑

人膀胱癌細胞系T24、5637和J82(中國科學院典藏培養(yǎng)物保藏委員會上海細胞庫)，MEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(Hyclone公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，米托蒽醌γ分泌酶抑制劑(Sigma公司)，Matrigel膠(BD公司)，RNA提取試劑盒(OMEAG公司)，反轉錄試劑盒(BIONEER公司)，vimentin多克隆抗體和E-cadherin單克隆抗體(CST公司)，α-smooth muscle actin多克隆抗體和N-cadherin單克隆抗體(Abcam公司)，β-actin單克隆抗體(Anbo公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：對照組T24，5637細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI- 1640培養(yǎng)基中，J82細胞培養(yǎng)于含10% FBS的MEM培養(yǎng)基中，細胞培養(yǎng)箱濕度為37 ℃，5% CO2。實驗組加5 μmol/L γ分泌酶抑制培養(yǎng)48 h。

1.2.2 RT- PCR方法檢測膀胱癌細胞E-cadherin、N-cadherin、vimentin、alpha-smooth muscle actin 的表達變化：用RNA提取試劑盒提取總RNA，Eppendorf核酸定量測定儀檢測RNA濃度和純度，并行瓊脂糖凝膠電泳，觀察RNA完整性。然后以2.0 μg RNA為模版反轉錄為cDNA。以β-actin作為內(nèi)參對照，PCR方法檢測E-cadherin、N-cadherin、vimentin和alpha-smooth muscle actin 的表達。各基因引物序列見表1。取PCR產(chǎn)物5 μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描成像系統(tǒng)對條帶吸光度進行分析。檢測各組目的基因擴增產(chǎn)物與其對應的內(nèi)參對照β-actin擴增產(chǎn)物A值，然后將A目的基因/Aβ-actin的比值進行統(tǒng)計學分析。

表1 引物序列及擴增產(chǎn)物Table 1 Oligonucleotide sequences for PCR amplification

1.2.3 Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin、vimentin、alpha-smooth muscle actin 的表達變化：提取各組細胞總蛋白，用BCA法進行蛋白定量。取等量蛋白質進行SDS-PAGE，和電轉移至PVDF膜，先后結合一抗和二抗后，ECL顯色曝光，顯影和定影。將膠片進行吸光度掃描。檢測各組目的蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白所對應的條帶A值，然后將A目的蛋白/Aβ-actin的比值進行統(tǒng)計學分析。

1.2.4 MTT比色試驗檢測細胞耐藥性變化：取對數(shù)生長期細胞，接種于96孔板，細胞密度為5 000個/孔，設米托蒽醌濃度梯度孔1、4、16、64和256 ng/mL，另設調零孔和對照孔，各組均為5個復孔。培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h后，加入DMSO 150 μL。用酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔在490 nm處的吸光度值。細胞抑制率 =(1-實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%

1.2.5 Transwell檢測膀胱癌細胞侵襲力的改變：用50 mg/L Matrigel 40 μL稀釋包被Transwell小室底部。取生長于對數(shù)期的各組細胞，配置成1×105個/mL細胞懸液，加入300 μL細胞懸液于Transwell小室，下室加入800 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)液。放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。取出培養(yǎng)板內(nèi)Transwell小室，經(jīng)漂洗、固定、染色后用棉簽小心擦去微孔膜內(nèi)層的細胞，倒置顯微鏡下每個樣本隨機取10個視野，計數(shù)移至微孔膜下層的細胞個數(shù)取平均值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1完全阻斷Notch信號通路對抑制膀胱癌細胞生長的影響

經(jīng)γ分泌酶抑制劑處理48 h后，鏡下發(fā)現(xiàn)細胞密度減小，細胞之間的連接減少，細胞出現(xiàn)皺縮、變小等形態(tài)改變，并發(fā)現(xiàn)凋亡細胞(圖1)。

2.2完全阻斷Notch信號通路對N-cadherin,vimentin,alpha-smoothmuscleactin和E-cadherinmRNA表達的影響

與對照組相比，γ分泌酶抑制劑(5 μmol/L)作用膀胱癌細胞T24、5637和J82 48 h后，EMT間質標志物N-cadherin、vimentin、alpha-smooth muscle actin的mRNA表達較對照組出現(xiàn)下調，而上皮標志物E-cadherin的mRNA水平表達較對照組出現(xiàn)上調(圖2)。

A.T24; B.5637; C.J82圖1 完全阻斷Notch信號通路抑制膀胱癌細胞生長Fig 1 Morpholog of Notch signaling pathway completely blocked on bladder cancer cells(×200)

A.T24; B.J82; C.5637; M.100 bp DNA ladder marker(700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 bp)； *P<0.05 compared with control圖2 完全阻斷Notch信號通路對N-cadherin, vimentin, alpha-smooth muscle actin和E-cadherin mRNA表達的影響

2.3完全阻斷Notch信號通路對N-cadherin,vimentin,alpha-smoothmuscleactin和E-cadherin蛋白表達的影響

與對照組相比，γ分泌酶抑制劑(5 μmol/L)作用膀胱癌細胞T24、5637和J82 48 h后，EMT間質標志物N-cadherin、vimentin、alpha-smooth muscle actin的蛋白表達較對照組出現(xiàn)下調，上皮標志物E-cadherin的蛋白表達較對照組出現(xiàn)上調(圖3)。

2.4MTT比色實驗檢測細胞耐藥性的變化

顯示米托蒽醌濃度為4、16和64 ng/mL實驗組細胞增殖抑制率較對照組明顯升高(表2)。

2.5完全阻斷Notch信號通路對膀胱癌細胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實驗結果顯示，實驗組穿過小室濾膜的膀胱癌細胞明顯少于對照組，即Notch信號通路受阻的膀胱癌細胞侵襲能力低于對照組(圖4)。

3 討論

膀胱癌的發(fā)生發(fā)展和轉移涉及到多層面生物學信息的調控。而相關研究相繼證實：Notch信號通路和EMT在許多人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉移中起著關鍵性的作用[5- 8]。然而在膀胱癌中， Notch信號通路和EMT之間的關系并未闡明。

A.Western blot; B.T24; C.J82; D.5637; *P<0.05 compared with control圖3 完全阻斷Notch信號通路對N-cadherin, vimentin, alpha-smooth muscle actin和E-cadherin 蛋白表達的影響

表2 全阻斷Notch信號通路后膀胱癌細胞對米托蒽醌耐藥性的影響

*P<0.05 compared with control.

Notch信號通路是一個保守的信號傳導通路[9]。研究表明，Notch信號通路的激活很大程度取決于γ-分泌酶的活性，且γ-分泌酶抑制劑(能夠同時阻斷所有Notch 受體亞型)目前正用于各種適應證的臨床實驗中[5，10]。因此本研究發(fā)現(xiàn)：全阻斷Notch信號通路后， 癌細胞數(shù)目均明顯減少、生長緩慢和分散。 新的研究認為：Notch具有促進細胞周期和抑制細胞凋亡功能[11]。對臨床組織標本檢測發(fā)現(xiàn)，在非侵襲性膀胱癌中Notch-1低表達，而侵襲性膀胱癌Notch- 1高表達[12]。綜合以推斷Notch信號通路在膀胱癌中可能起著致癌作用，其原因可能與Notch1高表達有關，然而其具體分子機制將有待進一步探討。

A.T24; B.5637; C.J82圖4 完全阻斷notch信號通路對膀胱癌細胞侵襲能力的影響Fig 4 Effect of Notch signaling pathway completely blocked on the invasiveness of bladder cancer cells(×100)

近些年來越來越多的研究表明：EMT可使癌細胞獲得更強的遷移能力，EMT被認為與癌癥的轉移相關[13]。誘導EMT會下調上皮標志物E-cadherin, α和β-catenin以及cytokeratins等的表達，也會上調間質標志物N-cadherin, vimentin、fibronectin、matrix metalloproteinase以及α-smooth muscle actin等表達[14]。在本次實驗中全阻斷Notch信號通路后可促使膀胱癌T24、5637、J82細胞上皮分子標志物E-cadherin表達上調，間質分子標志物N-cadherin, vimentin以及α-smooth muscle actin表達下調；Transwell實驗檢測發(fā)現(xiàn)，實驗組膀胱癌細胞的侵襲力顯著下降。因此，該實驗表明全阻斷Notch信號通路可抑制膀胱癌發(fā)生EMT，進而降低膀胱癌細胞的侵襲能力。

相關研究表明EMT與癌細胞耐藥性密切相關，這些藥物包括傳統(tǒng)的化療藥物紫杉醇、長春新堿、奧沙利鉑、吉西他濱和表皮生長因子受體靶向藥物[15]。本實驗發(fā)現(xiàn)全阻斷Notch信號通路細胞增殖抑制率顯著高于對照組，表明在膀胱癌中，全阻斷Notch信號通路調控EMT與膀胱癌的耐藥性密切相關。這提示Notch信號通路的激活可促使腫瘤細胞發(fā)生EMT，進而使腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性。

綜上所述，本實驗采用γ-分泌酶抑制劑全阻斷Notch信號通路的方法，初步證實了全阻斷Notch信號通路可抑制膀胱癌EMT的發(fā)生以及促使EMT相關標志物的逆向表達，進而使膀胱癌細胞侵襲能力及耐藥性發(fā)生改變。本實驗為在膀胱癌中進一步研究Notch信號通路與EMT的關系提供了依據(jù)，在后續(xù)實驗中，將深入探討Notch信號通路調控EMT的關鍵分子，為Notch信號通路調控EMT繪制精確的信號調控網(wǎng)絡，最終為探尋膀胱癌發(fā)生發(fā)展、轉移和耐藥性提供新的思路和方法。

[1] Ploeg M, Aben KK, Kiemeney LA. The present and future burden of urinary bladder cancer in the world[J]. World J Urology,2009, 27:289- 293.

[2] Yao D, Dai C, Peng S. Mechanism of the mesenchymal-epithelial transition and its relationship with metastatic tumor formation[J]. Mol Cancer Res, 2011, 9:1608- 1620.

[3] Floor S, van Staveren WC, Larsimont D,etal. Cancer cells in epithelial-to-mesenchymal transition and tumor-propagating-cancer stem cells: distinct, overlapping or same populations[J]. Oncogene,2011, 30:4609- 4621.

[4] Gomes LR, Terra LF, Sogayar MC,etal. Epithelial-mesenchymal transition: implications in cancer progression and metastasis[J]. Curr Pharma Biotechnol, 2011, 12:1881- 1890.

[5] Wang Z, Li Y, Kong D,etal. The role of Notch signaling pathway in epithelial-mesenchymal transition (EMT) during development and tumor aggressiveness[J]. Curr Drug Targets, 2010, 11:745- 751.

[6] Ohashi S, Natsuizaka M, Naganuma S,etal. A NOTCH3-mediated squamous cell differentiation program limits expansion of EMT-competent cells that express the ZEB transcription factors[J]. Caner Res, 2011, 71:6836- 6847.

[7] Ishida T, Hijioka H, Kume K,etal. Notch signaling induces EMT in OSCC cell lines in a hypoxic environment[J]. Oncology Lett,2013, 6:1201- 1206.

[8] Li Y, Ma J, Qian X,etal. Regulation of EMT by Notch Signaling Pathway in Tumor Progression[J]. Curr Cancer Drug Targets, 2013,13: 957- 962.

[9] Espinoza I, Miele L. Notch inhibitors for cancer treatment[J]. Pharm Ther,2013, 139:95- 110.

[10] Acloque H, Adams MS, Fishwick K,etal. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease[J]. J Clin Invest, 2009, 119:1438- 1449.

[11] Joshi I, Minter LM, Telfer J,etal. Notch signaling mediates G1/S cell-cycle progression in T cells via cyclin D3 and its dependent kinases[J]. Blood, 2009, 113:1689- 1698.

[12] Shi TP, Xu H, Wei JF,etal. Association of low expression of notch- 1 and jagged- 1 in human papillary bladder cancer and shorter survival[J]. J Urol, 2008, 180:361- 366.

[13] Pandya K, Meeke K, Clementz AG,etal. Targeting both Notch and ErbB- 2 signalling pathways is required for prevention of ErbB- 2-positive breast tumour recurrence[J]. Bri J Cancer,2011, 105:796- 806.

[14] Grego-Bessa J, Diez J, Timmerman L,etal. Notch and epithelial-mesenchyme transition in development and tumor progression: another turn of the screw[J]. Cell Cycle, 2004, 3:718- 721.

[15] Sabbah M, Emami S, Redeuilh G,etal. Molecular signature and therapeutic perspective of the epithelial-to-mesenchymal transitions in epithelial cancers[J]. Drug resistance updates: reviews and commentaries in antimicrobial and anticancer chemotherapy, 2008, 11:123- 151.

新聞點擊

腸道細菌可影響人的體質量

據(jù)英國《BBC新聞》(BBC NEWS)2013年11月2日報道，兩份最新的研究發(fā)現(xiàn)，人體腸道內(nèi)的細菌可能與人們是否增加肥胖或減輕體質量有關。研究人員認為，市面上流行的胃分流術似乎因平衡移轉腸道內(nèi)的細菌而減輕體質量。

進行胃分流術的人通常會減少65%～75%的體質量，科學家先前對其中的理由未能完全理解?，F(xiàn)在，研究人員找到了原因：細菌的變化減輕了20%的體質量。哈佛醫(yī)學院附屬麻州總醫(yī)院新陳代謝科醫(yī)生柯普蘭(Lee M. Kaplan)說，這些發(fā)現(xiàn)意味著終有一天，通過腸道內(nèi)微生物水平的調整，人們將可不需手術就能達到減輕體質量的目的。

在針對小鼠的研究中，研究人員使用了3組養(yǎng)肥的小鼠。第1組進行胃分流術，其他兩組切斷腸后重新縫合的“假”手術。他們發(fā)現(xiàn)進行胃分流術小鼠的微生物種群很快改變，然后小鼠體質量減輕了。在“假”手術組中，微生物種群改變不多。

柯普蘭說，下一步他們可能將進行過胃分流術手術的人糞便移植到老鼠體內(nèi)，來了解是否會讓它們減輕體質量。接著，會進行人對人的糞便移植實驗?！按送?，我們找到了4個細菌的子群，它們似乎在胃分流術后增強了。另一個研究方法可能要對于1個菌群的調節(jié)效果進行了解。”

另一個針對人類的研究則發(fā)現(xiàn)，體質量過重的人可能是因為腸道內(nèi)常駐的某些特定的微生物。這些微生物可能通過協(xié)助其他生物體消化部分營養(yǎng)和制造更多能量的方式讓人們的體質量增加。

該研究發(fā)表于《臨床內(nèi)分泌與代謝》期刊。

Notch signaling pathway regulates epithelial-mesenchymal transition and affects the invasiveness and drug resistance of bladder cancer

LIU Zhi-huan1, WANG Yi-bing1, WANG Gong-xian1,2, HUANG Liang1, LANG Bin3, XU Xiao-yuan4, FU Bin1,2*

(1.Dept. of Urology, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006; 2.Jiangxi Institute of Urology, Nanchang 330006; 3.School of Health Sciences, Macao Polytechnic Institute, Macao 999078; 4.Key Laboratory of System Bio-medicine of Jiangxi Province, Medical College of Jiujiang University, Jiujiang 332000, China)

ObjectiveTo investigate the effect of notch signaling pathway on drug resistance and invasiveness of bladder cancer.MethodsWe observed the changes of growth and morphology of bladder cancer T24, 5637 and J82 cells which treated for 48 hours using γ-secretase inhibitor by inverted microscope. The mRNA and protein levels of the EMT molecular markers, including E-cadherin, N-cadherin, vimentin and Alpha-smooth muscle actin were examined by RT-PCR and Western blot in bladder cancer cells; Detected the changes of drug resistance and invasion respectively by MTT and Transwell in bladder cancer cells.ResultsAfter completely blocking the Notch signaling pathway, the inverted microscope showed that bladder cancer cells became smaller and more disperse; RT-PCR and Western blot showed the mRNA and protein levels of E-cadherin were up-regulated (P<0.05), contrast, N-cadherin, vimentin and Alpha-smooth muscle actin were down-regulated (P< 0.05); The proliferation of bladder cancer cells were significantly inhibited by MTT test; The number of through microporous membrane cells significantly decreased (P<0.05) shown by Transwell test.ConclusionsThe Notch signaling pathway is completely blocked that nhibites proliferation and EMT of bladder cancer cells, reduces drug resistance and invasion in bladder cancer cells. It suggests that drug resistance and invasiveness of bladder cancer can be changed through EMT which is regulated through notch signaling pathway.

bladder cancer; Notch signal; epithelial-mesenchymal transition; γ-secretase inhibitor

2014- 03- 03

：2014- 09- 16

國家自然科學基金(811606272)；江西省自然科學基金(800GZY0039)；江西省青年科學家基金(2010JX02761)；澳門科學技術發(fā)展基金(064/2012/A)

*通信作者(correspondingauthor)：urodoc@126.com

1001-6325(2015)02-0145-07

R737.14

：A