劉 威，段 林，許光明，于 峰，張曉靜*，宋 寧*

(1.河北省胸科醫(yī)院 骨科， 河北 石家莊 050041；2.河北醫(yī)科大學 第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科， 河北 石家莊 050000；3.河北醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 法醫(yī)學系， 河北 石家莊 050017)

?

CCK- 8降低LPS誘導的小鼠單核細胞RAW264.7 CHOP/caspase- 11 /caspase- 1的表達

劉 威1，段 林2，許光明3，于 峰3，張曉靜3*，宋 寧2*

(1.河北省胸科醫(yī)院 骨科， 河北 石家莊 050041；2.河北醫(yī)科大學 第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科， 河北 石家莊 050000；3.河北醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 法醫(yī)學系， 河北 石家莊 050017)

目的探討CCK- 8對LPS激活RAW264.7細胞CHOP/caspase- 11/caspase- 1 信號通路的影響。方法用LPS和(或) CCK- 8和(或) CCK- 8的1受體阻滯劑孵育RAW 264.7細胞，用Western blot法檢測CHOP、caspase- 11蛋白表達，用試劑盒檢測caspase- 1活性，用ELISA技術檢測細胞培養(yǎng)上清中IL- 1β水平。結果與對照組相比，LPS組CHOP、caspase- 11表達水平均顯著升高(P<0.05)，給予CCK- 8可有效抑制LPS誘導的CHOP、caspase- 11表達升高(P<0.05)，而預先給予CCK- 8的1受體阻滯劑可明顯抑制CCK- 8的作用。caspase- 1活性變化、IL- 1β含量變化趨勢均與CHOP、caspase- 11表達水平變化趨勢一致(P<0.05)。結論CCK- 8通過受體1抑制CHOP/caspase- 11/caspase- 1表達，減少LPS誘導IL- 1β的生成, 發(fā)揮抗炎作用。

膽囊收縮素；脂多糖；C/EBP同源蛋白；caspase- 11；caspase- 1

內(nèi)毒素的主要成分為脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，是革蘭陰性菌外膜的主要成分。LPS誘導巨噬細胞活化釋放大量促炎性細胞因子在急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征和多器官功能障礙綜合征等危重病癥的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[1- 2]。八肽膽囊收縮素(cholecystokinin octapeptide，CCK- 8)是廣泛存在于體內(nèi)多個系統(tǒng)的神經(jīng)肽，具有多種生物學功能。本研究經(jīng)過前期實驗證實，CCK- 8作用于表達CCK受體的巨噬細胞通過激活多條信號通路，抑制LPS誘生多種促炎因子，提示CCK- 8的抗炎作用對于治療炎性反應相關性疾病具有較好的應用前景[3- 6]。在 LPS誘導下巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志蛋白轉錄因子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)表達增高，上調(diào)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶- 11(cysteinyl aspartate specific proteinase 11，caspase- 11)表達，激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶- 1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1，caspase- 1)，促進IL- 1β生成，表明CHOP/caspase- 11/caspase- 1 信號通路在LPS啟動巨噬細胞炎性反應過程中發(fā)揮重要作用[7- 8], CCK- 8對上述信號通路的調(diào)節(jié)作用尚不清楚，研究CCK- 8對LPS誘導巨噬細胞CHOP/caspase- 11/caspase- 1通路的影響對于闡明CCK- 8的抗炎機制以及藥物開發(fā)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：小鼠單核細胞RAW264.7(中科院上海細胞庫)。以含體積分數(shù)為0.1胎牛血清，1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。2 d傳代1次，取對數(shù)增殖期細胞進行實驗。

1.1.2 實驗藥物：胎牛血清(杭州四季青公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)，LPS(E.coli LPS，serotype 0111:B4)，CCK- 8(Sigma公司)，Caspase 1 Assay Kit和小鼠抗兔caspase- 11抗體(Abcam公司)，小鼠抗兔CHOP抗體(Bioworld公司)，CCK- 81受體阻滯劑 devazepide(Tocris公司)，IL-1β ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組及處理: 小鼠單核細胞RAW264.7細胞傳2～3代后隨機分6組，分別為對照組(培養(yǎng)基中加入等體積0.9%氯化鈉注射液)、LPS組(培養(yǎng)基中加入0.5 mg/μL LPS)、CCK- 8+LPS組(在加入LPS前10 min加入1×10-6mol/L CCK- 8)、CCK- 81受體阻滯劑+ CCK- 8+LPS組(在加入CCK- 8前10 min加入1×10-3mol/L CCK- 8的1受體阻滯劑devazepide)、CCK- 8的1受體阻滯劑組(培養(yǎng)基中加入1×10-3mol/L devazepide)、CCK- 8組(培養(yǎng)基中加入1×10-6mol/L CCK- 8)。1.2.2 Western blot檢測CHOP、caspase- 11蛋白表達：收集細胞，加500 μL裂解液，20 μL蛋白酶抑制劑，5 μL PMSF在冰上裂解15 min后，4 ℃,14 000×g，離心15 min。蛋白定量后，采用聚丙烯酰胺凝聚電泳(SDS-PAGE)，通過電轉移法將蛋白轉移至PVDF濾膜上。用體積分數(shù)為0.05的脫脂奶粉封閉3 h，與1∶500的小鼠抗兔CHOP抗體(或小鼠抗兔caspase- 11抗體)4 ℃孵育過夜。再與1∶5 000 HRP標記的熒光標記羊抗兔IgG抗體室溫孵育2 h。用熒光顯色儀顯色。采用β-tublin作為內(nèi)參對照，分別以相應蛋白與β-tublin熒光強度比值表示該蛋白相對表達水平。

1.2.3 比色分析法測定caspase- 1活性：按照試劑盒說明書操作步驟收集細胞(2×106個細胞/mL)，加預冷50 μL裂解液，冰浴10 min，10 000×g，離心1 min，轉移上清至新試管，進行蛋白濃度定量，調(diào)整蛋白濃度為4 g/L，加50 μL含DTT的反應液，5 μL 4 mmol/L YVAD-p-NA，37 ℃孵育1～2 h，用酶標儀測定樣品在400 nm處的吸光度值(A400值)。將對照組吸光度值定為1，caspase- 1活性增高的倍數(shù)用其他組吸光度值與對照組吸光度值的比值表示。

1.2.4 ELISA方法測定IL-1β表達水平：藥物處理后收集細胞培養(yǎng)上清液，4 ℃，1 500 r/min，離心10 min，分裝，-80 ℃凍存。取上清，根據(jù)IL-1β檢測試劑盒說明書所示方法用酶標儀測定樣品在450 nm處的吸光度值(A450值)。根據(jù)標準品的結果繪制標準曲線，直線回歸分析得出直線回歸方程。將測得的不同檢測樣品的A值代入相應的直線回歸方程中，即可得到IL-1β的含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1CCK-8抑制LPS誘導的RAW264.7細胞CHOP蛋白的表達

與對照組相比，LPS組CHOP表達明顯增高，預先給與CCK- 8可明顯抑制LPS引起的CHOP表達的增高(P<0.05)。而在應用CCK- 8之前預先應用devazepide可明顯抑制CCK- 8的作用(P<0.05)。CCK- 8組和devazepide組CHOP表達水平與對照組相比無明顯差異(P<0.05) (圖1)。

A.the CHOP expression was detected by Western blot; B.densitometry analysis of CHOP expression; data were representative of four independent experiments; #P<0.05 compared with control group; *P<0.05 compared with LPS group; ▲P<0.05 compared with CCK- 8+LPS group圖1 CCK- 8對LPS誘導RAW264.7細胞CHOP蛋白表達水平的影響Fig 1 Effect of CCK- 8 on the CHOP expression induced by LPS in RAW264.7 cell

2.2CCK-8抑制LPS誘導的RAW264.7細胞caspase-11蛋白的表達

與對照組相比，LPS組caspase- 11表達水平顯著升高。與LPS組相比，CCK- 8 +LPS組caspase- 11的表達明顯降低(P<0.05)，預先給與devazepide可明顯抑制CCK- 8的作用(P<0.05) (圖2)。

A.the caspase- 11 expression was detected by Western blot; B.densitometry analysis of caspase- 11 expression; data were representative of four independent experiments; #P<0.05 compared with control group; *P<0.05 compared with LPS group; ▲P<0.05 compared with CCK- 8+LPS group圖2 CCK- 8對LPS誘導RAW264.7細胞caspase- 11蛋白表達水平的影響Fig 2 Effect of CCK- 8 on the caspase- 11 expression induced by LPS in RAW264.7 cell

2.3CCK-8抑制LPS誘導的RAW264.7細胞caspase-1活性增加

LPS誘導caspase- 1活性增加，約為對照組的1.47倍；CCK+LPS組caspase- 1活性較LPS組有所下降，約為對照組caspase- 1活性的1.24倍。預先給與devazepide可明顯抑制CCK- 8的作用，caspase- 1活性為對照組caspase- 1活性的1.38倍(圖3)。

Data were representative of four independent experiments; #P<0.01 compared with control group; *P<0.01 compared with LPS group; ▲P<0.01 compared with CCK- 8+LPS group圖3 CCK- 8對LPS誘導的RAW264.7細胞caspase- 1活性的影響Fig 3 Effect of CCK- 8 on the caspase- 1 activity induced by LPS in RAW264.7 cell

2.4CCK-8抑制LPS誘導的RAW264.7細胞IL-1β生成增多

與對照組相比，LPS組IL-1β表達明顯增高。與LPS組相比，CCK+LPS組IL-1β的表達明顯降低(P<0.05)，預先應用devazepide可明顯抑制CCK- 8的作用 (P<0.05) (表 1)。

表1 CCK- 8對LPS誘導RAW264.7細胞培養(yǎng)上清中IL-1β水平的影響

#P<0.05 compared with control group;*P<0.05 compared with LPS group;▲P<0.05 compared with CCK- 8+LPS group.

3 討論

CHOP(C/EBP-homologous protein)，又稱生長停滯及DNA損傷誘導基因153(growth arrest and DNA damage inducible gene 153, GADD153)，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)特異的轉錄因子之一。在生理狀態(tài)下低表達，但在ERS時，被顯著誘導表達，調(diào)節(jié)下游凋亡相關基因的轉錄，引起細胞凋亡[9]。LPS可以誘發(fā)巨噬細胞產(chǎn)生ERS，促進CHOP的表達，但并不引起巨噬細胞凋亡卻啟動了炎性相關的信號通路，促進IL-β的表達[7]，另有研究證實，與野生型小鼠相比，敲除CHOP基因的小鼠經(jīng)LPS刺激后，肺泡灌洗液中IL-1β的含量明顯降低，肺臟炎性病理改變明顯減輕。表明CHOP的表達可能是LPS活化巨噬細胞炎癥信號通路中的關鍵環(huán)節(jié)[10]。因此，控制巨噬細胞CHOP表達對抑制LPS誘生促炎因子具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS作用細胞可引起CHOP蛋白表達顯著增高，預先給予CCK- 8可明顯抑制LPS誘導的CHOP蛋白表達增高，而CCK- 81受體抑制劑可有效逆轉CCK- 8的作用，提示CCK- 8通過1受體抑制LPS誘導的RAW264.7細胞的ERS, 降低CHOP表達。

敲除CHOP基因可抑制LPS作用誘導巨噬細胞caspase- 11表達，表明CHOP是LPS誘導巨噬細胞caspase- 11表達的關鍵因子[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，CCK- 8可明顯抑制LPS誘導的caspase- 11蛋白表達增高，這一作用可被CCK- 81受體抑制劑反轉，caspase- 11的變化趨勢與CHOP的變化趨勢一致，提示CCK- 8通過1受體抑制CHOP的表達，降低caspase- 11的表達。caspase- 11可以通過蛋白水解作用激活caspase- 1[8]。本研究進一步檢測caspase- 1活性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS刺激，caspase- 1活性顯著升高， CCK- 8可明顯抑制LPS誘導的caspase- 1活性增加，這一效應可被1受體抑制劑所反轉，結果與caspase- 11表達水平變化趨勢一致，上述實驗結果表明，CCK- 8通過1受體抑制LPS誘導的CHOP/caspase- 11/caspase- 1的表達。caspase- 1又稱白介素- 1β 轉化酶(interleukin- 1β-converting enzyme，ICE)[11]。CHOP/ caspase- 11/ caspase- 1 信號通路是LPS誘導IL-β生成的關鍵通路，為了驗證上述實驗結果，本研究又觀察了細胞培養(yǎng)上清IL-β水平變化，結果證實CCK- 8可通過1受體降低IL-β的生成。

本研究證實，CCK- 8通過1受體抑制LPS誘導的CHOP/caspase- 11/ caspase- 1的表達，減少炎性因子IL-β的生成，對于闡明CCK- 8的抗炎機制，豐富CCK- 8及相關神經(jīng)肽生物學作用的有關理論具有重要意義，同時也有利于CCK- 8相關抗炎藥物的開發(fā)應用。

[1] 張偉, 蔣耀光, 李磊. 肺泡巨噬細胞與急性肺損傷[J]. 創(chuàng)傷外科雜志, 2003, 5:389- 391.

[2] 韋鵬, 周曉紅, 凌毅群, 等. 硫化氫在脂多糖所致大鼠急性肺損傷中的作用[J]. 基礎醫(yī)學與臨床，2006, 26:1517- 1519.

[3] Xu SJ, Gao WJ, Cong B,etal. Effect of lipopolysaccharide on expression and characterization of cholecystokinin receptors in rat pulmonary interstitial macrophages[J]. Acta Pharmacol Sin, 2004, 25: 1347- 1353.

[4] Xu SJ, Gao WJ, Cong B,etal. Effect of cholecystokinin octapeptide on diacylglycerol-PKC signaling pathway in rat pulmonary interstitial macrophages stimulated by lipopolysaccharide[J]. Acta Pharmacol Sin, 2005, 26: 1497- 1504.

[5] Li SJ, Ni ZY, Cong B,etal. CCK- 8 inhibits LPS-induced IL-1β production in pulmonary interstitial macrophages by modulating PKA, P38, and NF-κB pathway[J]. Shock, 2007; 27:678- 686.

[6] 李淑瑾, 姚玉霞, 朱桂軍, 等. 八肽膽囊收縮素抑制脂多糖誘導的大鼠肺間質(zhì)巨噬細胞TNF-α 轉錄及NF-κB 活性[J]. 中國病理生理雜志, 2004, 20:1335- 1339.

[7] Endo M, Mori M, Akira S,etal. C-EBP Homologous protein(CHOP) is crucial for the induction of caspase- 11 and the pathogenesis of lipopolysaccaride-induced inflammation[J]. J Immunol, 2006, 176: 6245- 6253.

[8] Wang S, Miura M, Jung YK,etal. Murine caspase- 11 and ICE-interacting protease, is essential for the activation of ICE[J]. Cell, 1998, 80:501- 509.

[9] Oyadomari S, Mori M. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress[J]. Cell Death and Differ, 2004, 11: 381- 389.

[10] Endo M, Oyadomari S, Suga M,etal. The ER stress pathway involving CHOP is activated in the lungs of LPS-treated mice[J]. J Biochem, 2005, 138:501- 507.

[11] Li P, Allen H, Banerjee S,etal. Mice deficient in IL-1-converting enzyme are defective in production of mature IL-1 and resistant to endotoxic shock[J]. Cell, 1995, 80:401- 411.

新聞點擊

注射肉毒桿菌可能緩解病痛

據(jù)英國《BBC新聞》(BBC NEWS)2013年10月30日報道，用于撫平皺紋的肉毒桿菌制劑“保妥適”(Botox)，可能有助減輕癌癥、關節(jié)炎與偏頭痛引發(fā)的不適，而且不會產(chǎn)生不良反應。長期遭受背痛的患者和曾剖宮產(chǎn)的女性，也能因注射“超級肉毒桿菌”受益。

注射一次能減輕疼痛數(shù)月，讓患者不須每天服用數(shù)次強效藥片，而且可注射于身體任何部位。這種由英國謝菲爾德大學(Sheffield University)研究人員研發(fā)的藥劑，可能會為治療疼痛帶來創(chuàng)新。

防止皺紋生成的主要成分是細菌毒素肉毒桿菌(botulinum)，能防止神經(jīng)細胞和肌肉互相作用，以阻止肌肉移動，進而防止皺紋生成。同時肉毒桿菌每次能阻止疼痛訊號傳遞達數(shù)月。然而因擔心會使治療部位癱瘓，而致肉毒桿菌未能普遍用于止痛。

為了解決這一問題，謝菲爾德大學研究人員達維勒托夫(Bazbek Davletov)取出肉毒桿菌能鎮(zhèn)痛的部分，再植入破傷風桿菌所產(chǎn)生類毒素中的兼容部分。

破傷風毒素會將鎮(zhèn)痛成分送至脊椎，這種成分就能在脊椎阻止疼痛訊號傳送至大腦。達維勒托夫教授指出：“事實上，我們達成止痛效果的方法就是，只選取有益的分子。”

動物試驗結果令人鼓舞，如果對人體進行的大型試驗成功，這種藥物3年后就可能問世?？捎糜谄^痛患者，也可能用于癌癥患者。

CCK- 8 decreases the expressions of CHOP/caspase- 11/caspase- 1 induced by LPS in mouse monocyte RAW264.7 cells

LIU Wei1, DUAN Lin2, XU Guang-ming3, YU Feng3, ZHANG Xiao-jing3*, SONG Ning2*

(1.Hebei Chest Hospital, Shijiazhuang 050041; 2.Dept. of Respiratory Medicine, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000; 3.Basic Medical College, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China)

ObjectiveTo investigate the effect of CCK- 8 on CHOP/caspase- 11/caspase- 1 expressions induced by LPS in RAW264.7 cells.MethodsRAW264.7 cells were incubated with LPS and/or CCK- 8 and/or CCK- 8 1R blocking agent devazepide for indicated times. CHOP and caspase- 11 protein expressions were determined by Western blot, caspase- 1 activity was analyzed by kit, IL- 1β expression level was analyzed by ELISA.ResultsBoth CHOP and caspase- 11 expression were upregulated in LPS-activated RAW264.7 cell, which were inhibited by pre-treatment of CCK- 8. Pre-treatment of devazepide inhibited the effects of CCK- 8 significantly.The same effects were found in caspase- 1 activity and IL- 1β expression.ConclusionsCCK- 8 exerts an anti-inflammatory effect by inhibiting CHOP/caspase- 11/caspase- 1 expressions induced by LPS in RAW264.7 cell. CCK 1R may contribute to the anti-inflammatory effect of CCK- 8.

cholecystokinin；lipopolysaccharides；C/EBP homologous protein；caspase- 11；caspase- 1

2014- 05- 12

：2014- 10- 14

河北省自然科學基金(H2012206029)

*通信作者(correspondingauthor)：zhangxue781127@163.com；342840431@qq.com

1001-6325(2015)02-0178-05

研究論文

R 541.4

：A