徐　莉，陳文慧，符靈梅，莊　鵬（海南省出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，海南海口570311）

近海養(yǎng)殖牡蠣中?；撬岷繖z測方法研究

徐莉，陳文慧，符靈梅，莊鵬
（海南省出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，海南?？?70311）

摘要：建立超高效液相色譜檢測近海養(yǎng)殖牡蠣中牛磺酸含量的方法。樣品經(jīng)水和乙腈超聲波輔助提取，所得樣液按給定條件采用丹磺酰氯柱前衍生，選用Agilent Extend-C18色譜柱，乙酸鈉-乙腈為流動(dòng)相等度洗脫，254 nm紫外波長下進(jìn)行分析。牛磺酸濃度在1.0 μg/mL～20 μg/mL范圍內(nèi)與其相應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系，方法的檢出限為0.05 μg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.51%～2.28%，回收率為92.2%～99.8%。

關(guān)鍵詞：牡蠣；超高效液相色譜；牛磺酸

牡蠣（Oyster）又名海蠣子，素有“海洋牛奶”之稱，是一種藥食同源的海洋生物，具有較高的營養(yǎng)物質(zhì)和一定的藥理作用。據(jù)報(bào)道該類水產(chǎn)動(dòng)物含有豐富的氨基酸，其中牛磺酸的含量幾乎占所有游離氨基酸的一半[1]。?；撬嶙鳛槿梭w的條件必需氨基酸，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，是調(diào)節(jié)正常生理功能的重要物質(zhì)，如可以穩(wěn)定人體細(xì)胞膜、調(diào)節(jié)滲透壓、抗氧化作用以及減少膽固醇的吸收等等[2]。此外，其還具有消炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛之功效及一定的抗腫瘤活性[3]。在西方發(fā)達(dá)國家的醫(yī)藥及食品添加劑行業(yè)，?；撬嵋训玫狡毡榈膽?yīng)用，近年來我國一些藥品生產(chǎn)企業(yè)也將其應(yīng)用于保健品中，由此可見?；撬嵋阎饾u引起了人們的重視。

?；撬岬臋z測方法主要有分光光度法[4]、滴定法、薄層色譜法[5]、氨基酸自動(dòng)分析法[6]和高效液相色譜法[7-8]等，其中前4種方法易受其它物質(zhì)干擾導(dǎo)致其使用范圍受到限制。高效液相色譜法憑借其靈敏度高、能夠快速對(duì)樣品進(jìn)行檢測而得到廣泛應(yīng)用，柱前衍生和柱后衍生是液相色譜方法的兩種前處理方式，與價(jià)格昂貴的柱后衍生相比較，前者更適合于推廣使用。本文選用水-乙腈為提取液，丹磺酰氯為衍生試劑，3%鹽酸溶液為終止液，采用超高效液相色譜法測定牡蠣中?；撬岬暮?。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

牡蠣：2014年8月采集于海南島東寨港、馬裊港、八所港和榆林港四大養(yǎng)殖海灣，清洗瀝干后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

?；撬針?biāo)準(zhǔn)品（CAS號(hào)：107-35-7，純度＞99%）：北京百靈威試劑有限公司；丹磺酰氯（色譜純）；乙腈（色譜純）；濃鹽酸、碳酸鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

UPLC液相色譜儀：美國Waters公司；超聲波清洗機(jī)：德國Elma公司；HWT-108水浴鍋：天津恒奧技術(shù)發(fā)展有限公司；電子分析天平AE240：上海梅特勒公司；320R冷凍離心機(jī)：UNIVERSAL公司；MS3 digital旋渦混合器：德國IKA公司。

1.3溶液配制

牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取60.4 mg?；撬針?biāo)準(zhǔn)品，加水定容至25 mL，得到濃度為2.39 mg/mL?；撬針?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使用時(shí)用水稀釋至所需濃度。

丹磺酰氯衍生劑：稱取50 mg丹磺酰氯，加乙腈溶解并定容至50 mL。

鹽酸終止液：量取300μL鹽酸溶液，加水至10mL；碳酸鈉溶液（pH9.5）：稱0.424 g碳酸鈉溶于100 mL水中，用鹽酸終止液調(diào)節(jié)pH至9.5；乙酸鈉流動(dòng)相（pH 4.2）：稱取0.574 g乙酸鈉溶于700 mL水中，乙酸調(diào)節(jié)pH至4.2。

1.4色譜條件

色譜柱：Agilent Extend C18柱（150 mm×5.0 mm× 4.6 μm）；柱溫：40℃；流動(dòng)相：乙酸鈉（pH4.2）+乙腈（乙酸鈉與乙腈體積比為65∶35）等度洗脫；流速：0.8 mL/min；紫外檢測器波長：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.5方法

1.5.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生

依次將?；撬針?biāo)準(zhǔn)工作液1.0 mL、碳酸鈉溶液1.0 mL、丹磺酰氯衍生劑300 μL加入10 mL試管中，封口，置于60℃水浴中反應(yīng)15 min，冷卻，加入100 μL鹽酸終止液，混勻，上機(jī)。

1.5.2樣品的前處理

將適量樣品用研磨機(jī)搗碎，稱取勻漿樣品1.0 g（精確至0.01 g）于25 mL比色管中，加入10 mL蒸餾水，超聲提取20 min，再加入乙腈定容至25 mL，渦旋離心，吸取適量上清液，加水至1 mL，按照1.5.1步驟進(jìn)行衍生化操作。

2　結(jié)果與分析

2.1提取液及沉淀劑的確定

?；撬崾且杂坞x形式存在于牡蠣組織中，且絕大部分存在于細(xì)胞內(nèi)，需要破壞細(xì)胞壁才能使?；撬岣玫臄U(kuò)散出來。文獻(xiàn)[8]所描述柱前衍生化法中樣品前處理提取液多用水溶解，然后加入不同的沉淀劑去除干擾物質(zhì)。綜合考慮?；撬嵋兹苡谒奶匦约安僮鞣€(wěn)定性兩方面因素，試驗(yàn)采取先加水超聲處理再加入乙腈渦旋提取的方式進(jìn)行前處理。結(jié)果表明，與直接提取相比較，超聲提取的回收率顯著提高，而選用乙腈作為二次提取液不僅能很好的沉淀牡蠣中的蛋白質(zhì)，也能有效的促進(jìn)組織中?；撬岬慕觥？疾烨疤幚磉^程中水、乙腈的比例以及超聲時(shí)間，最終確定水和乙腈的比例為2∶3，超聲提取時(shí)間為20 min，在該條件下有效排除雜質(zhì)干擾的同時(shí)也獲得較佳的回收率。2.2衍生反應(yīng)條件的選擇

由于?；撬嶙陨淼淖贤馕蛰^弱，需進(jìn)行衍生化后方能提高其檢測的靈敏度。丹磺酰氯作為常用的衍生劑，在與牛磺酸發(fā)生衍生反應(yīng)時(shí)需要堿性催化劑的存在，試驗(yàn)選用pH為9.5的碳酸鈉溶液取得了較好的衍生結(jié)果。此外，為了避免丹磺酰氯與?；撬岚l(fā)生進(jìn)一步的反應(yīng)，選擇3%鹽酸溶液作為反應(yīng)終止液有效的抑制了鏈接反應(yīng)的發(fā)生。試驗(yàn)考察了衍生反應(yīng)所需的溫度、時(shí)間以及衍生劑的用量3個(gè)影響因素，結(jié)果表明：過高的水浴溫度會(huì)導(dǎo)致測定結(jié)果不穩(wěn)定，平行效果差；衍生劑加入量過少會(huì)導(dǎo)致衍生化時(shí)間過長且不完全；因此在60℃的水浴中，加入300 μL濃度為5 mg/mL丹磺酰氯衍生劑，反應(yīng)15 min時(shí)，牡蠣中?；撬岬臏y定可獲得較理想的回收率。

2.3色譜條件的優(yōu)化

調(diào)節(jié)流動(dòng)相乙酸鈉-乙腈的比例發(fā)現(xiàn)：隨著乙腈的配比加大，溶劑峰與目標(biāo)峰無法分離；而當(dāng)乙腈比例減少時(shí)，目標(biāo)物出峰時(shí)間不斷延長，但響應(yīng)下降明顯，靈敏度降低且峰形扁平?？紤]到在流動(dòng)相中，?；撬崤c丹磺酰氯生成的衍生物中游離的磺酸基會(huì)發(fā)生電離導(dǎo)致峰形變差，因此試驗(yàn)選擇合適流動(dòng)相配比的同時(shí)調(diào)節(jié)乙酸鈉的pH，以獲得較佳的分離度和峰形。試驗(yàn)結(jié)果顯示流動(dòng)相的pH為4.2，乙酸鈉與乙腈的配比為65∶35時(shí)，峰面積最大，峰形對(duì)稱且分離度良好，完全可以滿足分析要求，對(duì)色譜柱的損害也很小。

2.4線性關(guān)系及檢出限

按照1.5.1試驗(yàn)方法對(duì)牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定，得到回歸方程為Y=9.98e+003X；相關(guān)系數(shù)為0.998 4，標(biāo)準(zhǔn)譜圖如圖1所示。

圖1　?；撬針?biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1　Chromatogram of standard of taurine

結(jié)果表明，?；撬岬臐舛仍?.0 μg/mL～20 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系，以3倍信噪比計(jì)算所得待測物檢出限質(zhì)量濃度為0.05 μg/mL。

2.5方法精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性

精密度是指多次測定結(jié)果的重復(fù)性，精密度常以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）來衡量。試驗(yàn)隨機(jī)選取一個(gè)已處理好的樣品溶液重復(fù)測定6次，結(jié)果計(jì)算所得RSD為0.56%，表明儀器的性能良好，適用于?；撬嵫苌锏姆治觥?/p>

為了考察所建立方法的重復(fù)性，分別稱取同一海灣養(yǎng)殖牡蠣樣品6份，按照1.5試驗(yàn)方法進(jìn)行處理并用上述優(yōu)化的色譜條件測定，計(jì)算牛磺酸衍生物峰面積的RSD為2.8%，說明該方法的重復(fù)性良好。

已完成衍生化的?；撬針?biāo)準(zhǔn)衍生溶液放置室溫下，分別于0、6、12、24 h進(jìn)行儀器測定，記錄峰面積及保留時(shí)間，結(jié)果顯示牛磺酸衍生物峰面積的RSD（n= 6）為1.3%，平均保留時(shí)間2.312 min，說明?；撬嵫苌镌谑覝貤l件下24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.6方法加標(biāo)回收率

在選定的色譜條件下，準(zhǔn)確稱取已知含量的牡蠣樣品，分別加入3個(gè)濃度水平的牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)液，按照1.5.2樣品前處理要求處理好樣品進(jìn)行測定，加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1　樣品加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)（n=6）Table 1　The spiked recoveries and precision of sample

試驗(yàn)表明在選定的色譜條件下進(jìn)樣分析，所建立方法重現(xiàn)性好，精密度高，準(zhǔn)確度好。

2.7樣品測定

將海南島東寨港、馬裊港、八所港和榆林港四大養(yǎng)殖海灣的牡蠣樣品分別進(jìn)行超聲、渦旋處理，吸取上清液后采用上述色譜方法進(jìn)行檢測，各養(yǎng)殖區(qū)域測定結(jié)果見表2，其色譜圖見圖2。

表2　牡蠣樣品中?；撬岷縏able 2　Determination of taurine in Ostrea by the methods

圖2　牛磺酸樣品衍生物的色譜圖Fig.2　Chromatogram of derivate of taurine in sample

4個(gè)港口牡蠣的?；撬岷颗c文獻(xiàn)報(bào)道新鮮牡蠣的含量15 mg/g有所差異。造成差異的原因可能是牡蠣苗產(chǎn)地、養(yǎng)殖水域的不同以及采集時(shí)間的區(qū)別，因?yàn)槟迪牭蓉愵愖陨聿荒芎铣膳；撬?，只能?duì)牛磺酸起到積蓄作用，8月份采集的牡蠣還未達(dá)到最佳的成熟期。

3　結(jié)論

本文選用超聲波處理，乙腈二次提取，丹磺酰氯為柱前衍生劑測定牡蠣中牛磺酸的含量，相比于其它所采用蛋白沉淀劑和直接提取的前處理方法應(yīng)用范圍更廣且方法穩(wěn)定性好，可適合于各種基質(zhì)復(fù)雜樣品的分析，大大減少了基體對(duì)檢測物質(zhì)出峰的干擾，操作簡便、快捷，并且該方法還能有效的提高了牛磺酸的檢測靈敏度和準(zhǔn)確性。

參考文獻(xiàn)：

[1]Fuentes,A Fernández-Segovia I,Serra JA,et al.Comparison of wild and cultured sea bass(Dicentrarchus labrax)quality[J].Food Chemistry,2010,119:1514-1518

[2]Marques,An Teixeira Br,Barrento S,et al.Chemical composition of Atlantic spider crab Maja brachydactyla:Human health implications [J].Journal of Food Composition and Analysis,2010,23:230-237

[3]龔麗芬,黃慰生,鄭志福,等.?；撬岬纳锘钚?、提取與測定[J].福建化工,2003(1):26-28

[4]李秀娟,魯曾,黃賢剛.牡蠣中牛磺酸含量測定方法的建立[J].安全與檢測,2010,26(5):81-83

[5]祖如松.食品中?；撬岬臏y定方法-薄層層析法[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,1998,8(5):292-296

[6]吳成業(yè),劉智禹.幾種牡蠣在保鮮中游離氨基酸和?；撬岬淖兓痆J].中國水產(chǎn)科學(xué),2000,7(3):120-123

[7]張玉玲,楊道華,張桂芝.HPLC法測定智杞顆粒中牛磺酸含量[J].湖北中醫(yī)雜志,2009,31(5):56-57

[8]黃曉杰,李京華,王俊德.柱前衍生化-高效液相色譜法測定?；撬岬臈l件優(yōu)化[J].食品工業(yè),2009(1):68-70

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.039

收稿日期：2014-11-05

基金項(xiàng)目：海南省科技興海項(xiàng)目（XH201407）

作者簡介：徐莉（1981—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：食品有害物質(zhì)檢測。

Study in Detection of Taurine Content in Aquaculture Oyster

XU Li，CHEN Wen-hui，F(xiàn)U Ling-mei，ZHUANG Peng
（Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Technology Center，Haikou 570311，Hainan，China）

Abstract：An UPLC method for determination taurine in oyster was established.The samples were extracted by ultrasonic assisted water and acetonitrile，an aliquot of the acetonitrile extract was taken and taurine in the extract was pre-column derivatized with dansyl chloride under prescribed condition.The analysis condition for UPLC consist of Agilent extend-C18column，sodium acetate-acetonitrile as mobile phase elution，254 nm wavelength.Linear relationship between values of peak area and concentration of taurine（determined as its derivate）was kept in the range of 1.0 μg/mL-20 μg/mL，the detection limit was 0.05 μg/mL，the relative standard deviation（RSD）ranged from 1.51%to 2.28%，the recovery rate was 92.2%-99.8%.

Key words：oysters；UPLC；taurine