楊清山，蔡榮華，徐　猛，王　磊，高　偉，*（.晨光生物科技集團股份有限公司，河北邯鄲05750；.河北省天然色素工程技術研究中心，河北邯鄲05750）

UPLC法測定咖啡豆中綠原酸和咖啡因的含量

楊清山1，2，蔡榮華1，徐猛2，王磊1，2，高偉1，2，*
（1.晨光生物科技集團股份有限公司，河北邯鄲057250；2.河北省天然色素工程技術研究中心，河北邯鄲057250）

摘要：建立了咖啡豆中綠原酸和咖啡因的超高效液相色譜測定方法?？Х榷狗鬯楹蠼?0%甲醇水溶液超聲提取后，在Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）上以酸性乙腈水為流動相，采用紫外檢測器在274 nm測定。在優(yōu)化試驗條件下，咖啡豆中綠原酸和咖啡因提取完全。綠原酸在88.4 mg/L～442 mg/L時峰強度與濃度成良好線性（r2= 0.999 3），相對標準偏差為2.81%，平均回收率為98.24%～99.72%?？Х纫蛟?8.8 mg/L～143 mg/L時峰強度與濃度成良好線性（r2=0.999 8），相對標準偏差為1.34%，平均回收率為98.50%～101.32%。方法準確可靠，適用于咖啡豆中綠原酸和咖啡因含量的測定。

關鍵詞：咖啡豆；綠原酸；咖啡因；UPLC

咖啡樹是屬茜草科多年生灌木或小喬木，而咖啡豆就是指咖啡樹果實里面的果仁。常飲用的咖啡是用咖啡豆配合各種不同的烹煮器具制作出來的。“咖啡”（coffee）一詞源自埃塞俄比亞的一個名叫卡法（kaffa）的小鎮(zhèn)，在希臘語中“Kaweh”的意思是“力量與熱情”?？Х群胸S富的活性物質，其中綠原酸類化合物占咖啡豆干重0.2%～10%，咖啡因占2%～8%左右[1]。綠原酸是一類與人類健康密切相關的生理活性物質，其中以5-咖啡?？崴幔?-O-caffeoylquinic acid，5-CQA）為主要成分。現代藥理學研究表明，綠原酸類化合物具有抗氧化、抗病毒、抗癌等多種作用，同時對高血脂、高血壓和動脈硬化硬化具有一定抑制作用[2-5]。咖啡因又稱咖啡堿，在醫(yī)藥上可作麻醉劑、興奮劑、利尿劑和強心劑[6]。龍文靜等研究了咖啡豆中的綠原酸類化合物測定方法[7]，賈桂燕等研究了咖啡中綠原酸和咖啡因的測定方法[8]，李春麗等研究了咖啡豆中咖啡因的測定方法[9]。本試驗建立了同時測定咖啡豆中綠原酸和咖啡因的超高效液相色譜法，方法簡單快捷、穩(wěn)定可靠，為咖啡豆的質量評價提供了參考。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

Waters超高效液相色譜儀，配有紫外檢測器和ACQUITY UPLC H-Class系統(tǒng)：美國Waters公司；BP211D電子天平：德國賽多利斯公司；FZ102微型植物粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；Millipore Q超純水器：美國Millipore公司；TH-300BQ數控超聲波清洗器：濟寧天華超聲電子儀器有限公司。

圖1　綠原酸和咖啡因標準品色譜圖Fig.1　Chromatogram of chlorogenic acid and caffeine

綠原酸標準品購買于貴州迪大生物科技有限公司，純度98%；咖啡因標準品購買于中國計量科學研究院，純度99.8%；冰醋酸、甲醇（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；乙腈（色譜純）：美國Fisher公司。

咖啡豆樣品：晨光生物科技集團股份有限公司提供。

1.2色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40℃；樣品室溫度：20℃；進樣量1 μL；流動相：10%乙腈水（冰醋酸調pH 2.75）；流速0.4 mL/min；檢測波長：274 nm。

1.3標準品溶液的配制

準確稱取單酸標準品10 mg和咖啡因標準品5 mg 至50 mL容量瓶中，用10%乙腈水定容，搖勻作為儲備液；用流動相逐級稀釋，依次稀釋2、4、8、16、32倍，作為標準工作液。

1.4樣品溶液的制備

將咖啡豆粉碎至40目通過率80%以上細度，并將篩上物和篩下物混合均勻后，作為待測樣。準確稱取1.000 g待測樣，置于100 mL容量瓶中，用70%甲醇溶液定容，室溫下超聲2 h，冷卻后過0.22 μm濾膜，進樣檢測。

和咖啡因均具有吸收，因此確定檢測波長為274nm。

2.2樣品前處理方法的優(yōu)化

2.2.1粉碎細度的選擇

咖啡豆在不同粉碎次數下的40目篩過篩率情況見表1。

表1　咖啡豆粉碎試驗數據Table 1　Data of coffee bean by smash test

咖啡豆質地較硬，常規(guī)粉碎方法無法滿足試驗要求，使稱取的樣品無法具有代表性或者粒度過大影響萃取效果，造成最終檢測誤差偏大。本試驗采取多次粉碎過篩的方式，將咖啡豆粉碎至40目通過率80%以上，使每次稱取的樣品都具有代表性且樣品在萃取過程達到最佳的效果。

2.2.2提取溶劑的選擇

不同體積分數的甲醇對咖啡豆粉的提取效果情況見圖2。

圖2　甲醇濃度優(yōu)化試驗Fig.2　Optimizing test of methanol concentration

2　結果與分析

2.1檢測波長的選擇

綠原酸和咖啡因標準品色譜圖見圖1。

咖啡因最大吸收波長為272nm，綠原酸最大吸收波長為327nm，經試驗發(fā)現在274nm波長條件下，綠原酸

試驗分別進行了30%、50%、70%和100%甲醇對咖啡豆粉中綠原酸和咖啡因的提取效果情況。結果表明，70%甲醇提取出的綠原酸和咖啡因含量均高于其他幾種提取溶劑，因此選擇70%甲醇作為提取溶劑。

2.2.3提取時間的選擇

不同超聲時間對咖啡豆粉的提取效果情況見圖3。

圖3　提取時間優(yōu)化試驗Fig.3　Optimizing test of extraction time

試驗分別進行了超聲輔助提取0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 h對咖啡豆粉中綠原酸和咖啡因的提取效果情況。結果表明，超聲輔助提取2.0 h的提取效果最好，因此選擇超聲輔助提取2.0 h作為最佳提取時間。

2.2.4稱樣質量的選擇

不同稱樣質量對咖啡豆粉的提取效果情況見圖4。

圖4　稱樣質量優(yōu)化試驗Fig.4　Optimizing test of sample weigh

試驗分別進行了樣品稱取質量為0.500、1.000、2.500、5.000 g對咖啡豆粉中綠原酸和咖啡因的提取效果情況。結果表明，稱樣質量為1.000 g時的提取效果最好，因此選擇稱樣質量1.000 g作為最佳稱樣量。

2.3線性關系和檢出限

取“1.3”中的混合標準工作液按照“1.2”條件下檢測，進行線性范圍考察，以綠原酸和咖啡因的峰面積（y）為縱坐標，以質量濃度（x，mg/L）為橫坐標，做標準曲線。結果表明：綠原酸在88.4 mg/L～442 mg/L時峰強度與濃度成良好線性，線性方程為y=4966567x-20076，r2=0.999 3；咖啡因在28.8 mg/L～143 mg/L時峰強度與濃度成良好線性，y=19 734 680x-55 406，r2=0.999 8。

2.4精密度試驗

取“1.3”中的混合標準工作液按照“1.2”條件下進樣檢測，進行精密度試驗，重復進樣6次，測定峰面積。結果表明：標樣中綠原酸和咖啡因的相對標準偏差分別為0.91%和0.68%。

2.5重復性試驗

選取同一份樣品，用“1.4”中方法進行制樣，按照“1.2”條件下進樣檢測，進行重復性試驗，樣品重復檢測6次，測定樣品中綠原酸和咖啡因含量。結果表明：樣品中綠原酸和咖啡因的相對標準偏差分別為2.81% 和1.34%。

2.6加標回收率試驗

選取同一份樣品，分別在其濃度附近進行加標，用“1.4”中方法進行制樣，按照“1.2”條件下進樣檢測，測定樣品中綠原酸和咖啡因加標回收率情況。結果表明：樣品中綠原酸和咖啡因的加標回收率分別為98.24%～99.72%和98.50%～101.32%。

3　結論

綜上所述，本試驗確定了一種簡單、快速并能準確測定咖啡豆中綠原酸和咖啡因含量的超高效液相色譜方法，為咖啡豆質量的評定提供參考方法。

本試驗方法經精密度、重復性和加標回收率等試驗驗證，其相對標準偏差均在規(guī)定的誤差范圍內，說明該處理方法及色譜條件適用于咖啡豆中綠原酸和咖啡因的定量分析，方法準確可靠。

本試驗建立的綠原酸檢測方法只適用于咖啡豆中主要成分5-咖啡?？崴幔?-O-caffeoylquinic acid，5-CQA）的含量測定，對于咖啡豆中所有綠原酸成分和咖啡因含量的同時測定需要其他學者做進一步研究。

參考文獻：

[1]許善偉.高效液相法測定咖啡豆提取物中綠原酸的含量[J].廣西醫(yī)學,2009,31(11):1702-1703

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[3]Iwai K,Kishimoto N,Kakino Y,et al.In Vitro Antioxidative Effects and Tyrosinase Inhibitory Activities of Seven Hydroxycinnamoyl Derivativesin Green CoffeeBeans[J].Jof Agricand Food Chem,2004, 52(15):4893-4898

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[6]黃雅志.喝咖啡能免除得膽結石的危險[J].云南熱作科技,2000,1 (1):23

[7]龍文靜,張盛,袁玲,等.反相高效液相色譜法同時測定咖啡豆中的6種酚酸類化合物[J].色譜,2011,29(5):439-442

[8]賈桂燕,魯巍巍,鄭毅男.咖啡中咖啡因和綠原酸的含量測定[J].黑龍江八一農墾大學學報,2008,20(3):64-67

[9]李春麗,賀明鑫.反相液相色譜法測定咖啡豆中咖啡堿含量[J].云南熱作科技,2000,23(3):10-12

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.035

收稿日期：2013-12-21

基金項目：國家國際科技合作專項（S2013ZR0319）

作者簡介：楊清山（1985—），男（漢），工程師，學士，研究方向：食品分析和檢測。

*通信作者：高偉，博士，高級工程師，研究方向：天然產物提取。

Determination of Chlorogenic Acid and Caffeine in Coffee Beans by UPLC

YANG Qing-shan1，2，CAI Rong-hua1，XU Meng2，WANG Lei1，2，GAO Wei1，2，*
（1.Chenguang Biotech Group Co.，Ltd.，Handan 057250，Hebei，China；2.Hebei Engineering Technology Research Center of Natural Pigments，Handan 057250，Hebei，China）

Abstract：A Ultra Performance Liquid Chromatographic method was developed for the determination of chlorogenic acid and caffeine in coffee beans.Coffee bean sample was smashed and ultraphonic extracted with methanol-water（70∶30，by volumn）.The separation of chlorogenic acid and caffeine were achieved with a Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）column by using a mixture of acidic property acetonitrile-water as the mobile phase.The ultraviolet detector was set at 274 nm.The chlorogenic acid and caffeine in coffee bean was extracted completely.There was a good linear relationship between chromatographic peak areas and the concentrations of chlorogenic acid in the range of 88.4 mg/L-442 mg/L with a correlation coefficient of 0.999 3. The RSDs of the method were in the range of 2.81%，and the average recoveries were between 98.24%and 99.72%.There was also a good linear relationship between chromatographic peak areas and the concentrations of caffeine in the range of 28.8 mg/L-143 mg/L with a correlation coefficient of 0.999 8.The RSDs of the method were in the range of 1.34%，and the average recoveries were between 98.50%and 101.32%.The results showed that the method was successfully applied in the analysis of chlorogenic acid and caffeine in coffee bean with its good repeatability and sensitivity.

Key words：coffee bean；chlorogenic acid；caffeine；UPLC