趙淑銳，鄭美青，吳英婷，薛　冰（首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測(cè)試中心，北京100069）

螺旋藻體外清除自由基的ESR研究

趙淑銳，鄭美青，吳英婷，薛冰
（首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測(cè)試中心，北京100069）

摘要：利用DPPH、Fenton反應(yīng)、SNAP、黃嘌呤氧化酶氧化黃嘌呤反應(yīng)產(chǎn)生活性有機(jī)氮自由基、羥自由基（·OH）、一氧化氮（NO）自由基、超氧陰離子（·O2-）自由基，以電子順磁共振法（ESR）研究了螺旋藻體外清除上述四種自由基的作用。該方法操作簡(jiǎn)單易行，結(jié)果直觀。結(jié)果表明螺旋藻能有效清除上述4種自由基，而且隨濃度的增加抗氧化能力也增加，濃度在40 mg/mL時(shí)對(duì)超氧陰離子和有機(jī)氮自由基的清除率達(dá)到了90%以上。

關(guān)鍵詞：螺旋藻；DPPH；羥自由基；一氧化氮自由基；超氧陰離子；電子順磁共振

tron paramagnetic resonance

自由基是一種含不成對(duì)電子的分子、原子或離子，是生物體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物[1]。常見(jiàn)的自由基有：超氧陰離子自由基、羥自由基、脂質(zhì)自由基、一氧化氮自由基、有機(jī)自由基等。自由基很不穩(wěn)定，極容易與其它物質(zhì)反應(yīng)生成新的自由基，因而產(chǎn)生連鎖反應(yīng)[2]。自由基通過(guò)各種不同的途徑，干擾重要的生理過(guò)程[3]，與心臟疾病、腦血管疾病、糖尿病、腫瘤、高血壓、衰老、皮膚皺紋、老年癡呆、老年性白內(nèi)障、靜脈曲張等70多種疾病有關(guān)[4]。因此，研究抑制自由基反應(yīng)的抗氧化劑有重大意義。

電子順磁共振（ESR）是直接檢測(cè)和研究含有未成對(duì)電子的順磁性物質(zhì)的一種現(xiàn)代分析方法[5]。ESR技術(shù)是利用具有單電子的物質(zhì)在靜磁場(chǎng)作用下吸收電磁波能量而完成電子能級(jí)間躍遷的這種特性，對(duì)順磁性的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)和分析，它也是檢測(cè)單電子的唯一直接的方法，ESR檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、無(wú)干擾、樣品不受破壞等優(yōu)點(diǎn)，是目前檢測(cè)自由基最直接、最有效的方法之一[6]。

近幾年有大量研究表明，螺旋藻具有降血脂、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、抗凝血、抗氧化及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等生物活性[7]。本實(shí)驗(yàn)利用電磁共振技術(shù)，選取常見(jiàn)的不同種自由基，初步研究了鈍頂螺旋藻對(duì)不同自由基的清除能力。

1　材料與方法

1.1材料

鈍頂螺旋藻粉：云南天然坊生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）、5，5-二甲基-1-氧化吡咯啉（DMPO）、S-亞硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP）、黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、二乙基三胺五乙酸（DETAPAC）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；N-甲基-葡萄糖胺（MGD）；二氧六環(huán)、30%過(guò)氧化氫：分析純，北京化工廠；七水合硫酸亞鐵：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水：美國(guó)Millipore公司Milli-Q Academic A10超純水系統(tǒng)生產(chǎn)。

1.2儀器設(shè)備

JES-FA300電子自旋共振儀及配套設(shè)備：石英標(biāo)準(zhǔn)樣品管（內(nèi)徑為4 mm）。

1.3方法

1.3.1樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取40 mg鈍頂螺旋藻粉，加1 mL蒸餾水，充分振蕩，得到濃度為40 mg/mL的懸濁液，然后用蒸餾水稀釋至20、10、5、1、0.5 mg/mL。

1.3.2試劑的配置

稱(chēng)取8 mg DPPH，溶解于10 mL二氧六環(huán)中，濃度為2×10-3mol/L。稱(chēng)取七水合硫酸亞鐵27.8 mg，溶解于10 mL蒸餾水中，濃度為10 mmol/L。稱(chēng)取MGD7.3 mg，溶解于1 mL蒸餾水中，濃度為25 mmol/L。稱(chēng)取SNAP 2.2 mg，溶解于10 mL蒸餾水中，濃度為1 mmol/L。將30%的H2O2用蒸餾水稀釋至濃度為1%的H2O2。稱(chēng)取黃嘌呤300 mg，溶于3.5 mL蒸餾水中，濃度為560 mmol/L。吸取黃嘌呤氧化酶100 μL，用蒸餾水稀釋至1 mL。稱(chēng)取DETAPAC 1 mg，溶解于3 mL蒸餾水中，濃度為0.9 mmol/L。稱(chēng)取DMPO 22.6 mg，溶于2 mL蒸餾水中，濃度為100 mmol/L，加入200 mg活性炭，攪拌10 min，過(guò)濾，備用。以上試劑均需現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.3Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH及清除活性測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)利用Fe2+經(jīng)H2O2氧化成Fe3+產(chǎn)生的羥自由基，由自旋捕捉劑DMPO捕捉，經(jīng)電子順磁共振儀掃描，得到羥自由基的特征譜圖。10 mmol/L的七水合硫酸亞鐵溶液，蒸餾水，100 mmol/L的DMPO水溶液，1%的H2O2溶液。以上4種試劑按順序各取5 μL注入EP管，混勻后快速裝入石英毛細(xì)管中，然后外加樣品保護(hù)測(cè)試管，一并放入ESR波譜儀的諧振腔中進(jìn)行測(cè)定，作為對(duì)照樣品，以扣除試劑本身對(duì)自由基的影響。測(cè)樣品時(shí)用樣品溶液代替蒸餾水，其余操作同上。每個(gè)濃度做3個(gè)平行樣，測(cè)量后取平均值，結(jié)果見(jiàn)圖1。

自由基清除率（%）的計(jì)算公式：I=（h0-hx）/h0×100，式中：h0為對(duì)照樣品中ESR譜信號(hào)強(qiáng)度測(cè)量值；hx為樣品中ESR譜信號(hào)強(qiáng)度測(cè)量值。由圖1可見(jiàn)，I值越大，清除自由基能力越強(qiáng)。樣品測(cè)試條件為：掃描時(shí)間1min、中心磁場(chǎng)336 mT、掃描寬度15 mT、微波功率1 mW、調(diào)制寬度0.35 mT。

1.3.4清除NO自由基的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)利用SNAP作為NO自由基供體，用鐵鹽絡(luò)合物MGD-Fe捕捉NO自由基。經(jīng)電子順磁共振儀掃描，得到一氧化氮自由基的特征譜圖。10 mmol/L的七水合硫酸亞鐵溶液，25 mmol/L的MGD水溶液，蒸餾水，1 mmol/L的SNAP水溶液。以上4種試劑按順序各取5 μL注入EP管，混勻后快速裝入石英毛細(xì)管中，然后外加樣品保護(hù)測(cè)試管，一并放入ESR波譜儀的諧振腔中進(jìn)行測(cè)定，作為對(duì)照樣品，以扣除試劑本身對(duì)自由基的影響。測(cè)樣品時(shí)用樣品溶液代替蒸餾水，其余操作同上。每個(gè)濃度做3個(gè)平行樣，測(cè)量后取平均值，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1　羥自由基（·OH）圖譜Fig.1　Spectrum of hydroxyl radical（·OH）

圖2　一氧化氮（NO）自由基圖譜Fig.2　Spectrum of nitric oxide radical（NO）

自由基清除率（%）的計(jì)算公式：I=（h0-hx）/h0×100，式中：h0為對(duì)照樣品中ESR譜信號(hào)強(qiáng)度測(cè)量值；hx為樣品中ESR譜信號(hào)強(qiáng)度測(cè)量值。由圖2可見(jiàn)，I值越大，清除自由基能力越強(qiáng)（見(jiàn)圖2）。樣品測(cè)試條件為：掃描時(shí)間1 min、中心磁場(chǎng)330 mT、掃描寬度15 mT、微波功率1 mW、調(diào)制寬度0.35 mT。

1.3.5清除超氧陰離子自由基的測(cè)定

本試驗(yàn)利用黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶反應(yīng)生成超氧陰離子，用DMPO捕捉超氧陰離子。經(jīng)電子順磁共振儀掃描，得到超氧陰離子的特征譜圖。100 mmol/L 的DMPO溶液，0.9 mmol/L的DETAPAC水溶液，560 mmol/L的黃嘌呤水溶液，蒸餾水，稀釋10倍后的黃嘌呤氧化酶水溶液。以上4種試劑按順序各取5 μL注入EP管，混勻后快速裝入石英毛細(xì)管中，然后外加樣品保護(hù)測(cè)試管，一并放入ESR波譜儀的諧振腔中進(jìn)行測(cè)定，作為對(duì)照樣品，以扣除試劑本身對(duì)自由基的影響。測(cè)樣品時(shí)用樣品溶液代替蒸餾水，其余操作同上。每個(gè)濃度做3個(gè)平行樣，測(cè)量后取平均值，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　超氧陰離子自由基（·O2-）圖譜Fig.3　Spectrum of Superoxide anion（·O2-）

自由基清除率（%）的計(jì)算公式：I=（h0-hx）/h0×100，式中：h0為對(duì)照樣品中ESR譜信號(hào)強(qiáng)度測(cè)量值；hx為樣品中ESR譜信號(hào)強(qiáng)度測(cè)量值。由圖3可見(jiàn)，I值越大，清除自由基能力越強(qiáng)。樣品測(cè)試條件為：掃描時(shí)間1 min、中心磁場(chǎng)336 mT、掃描寬度15 mT、微波功率5 mW、調(diào)制寬度0.05 mT。

1.3.6清除DPPH有機(jī)自由基的測(cè)試方法

2×10-3mol/L的DPPH溶液，蒸餾水，以上2種試劑各取10 μL注入EP管，混勻后快速裝入石英毛細(xì)管中，然后外加樣品保護(hù)測(cè)試管，一并放入ESR波譜儀的諧振腔中進(jìn)行測(cè)定，作為對(duì)照樣品，以扣除試劑本身對(duì)自由基的影響。測(cè)樣品時(shí)用樣品液代替蒸餾水，其余操作同上。每個(gè)濃度做3個(gè)平行樣，測(cè)量后取平均值，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　DPPH有機(jī)氮自由基圖譜Fig.4　Spectrum of organic nitrogen radicals（DPPH）

自由基清除率（%）的計(jì)算公式：I=（h0-hx）/h0×100，式中：h0為對(duì)照體系中ESR譜信號(hào)強(qiáng)度測(cè)量值；hx為樣品體系中ESR譜信號(hào)強(qiáng)度測(cè)量值。由圖4可見(jiàn)，I值越大，清除自由基能力越強(qiáng)（見(jiàn)圖4）。

樣品測(cè)試條件為：掃描時(shí)間1 min；中心磁場(chǎng)中心磁場(chǎng)336 mT、掃描寬度15 mT、微波功率1 mW、調(diào)制寬度0.35 mT。

2　結(jié)果與討論

2.1螺旋藻對(duì)不同自由基的清除作用

2.1.1螺旋藻對(duì)羥自由基的清除效果

螺旋藻對(duì)羥自由基的清除效果見(jiàn)圖5。

圖5　不同濃度的測(cè)試樣品對(duì)羥自由基（·OH）的清除效果圖Fig.5　Scavenging effect of different concentrations of test samples on hydroxyl radical（·OH）

2.1.2螺旋藻對(duì)一氧化氮自由基的清除效果

螺旋藻對(duì)一氧化氮自由基的清除效果見(jiàn)圖6。

2.1.3螺旋藻對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果

螺旋藻對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果見(jiàn)圖7。

圖7　不同濃度的測(cè)試樣品對(duì)超氧陰離子（·O2-）自由基的清除效果圖Fig.7　Scavenging effect of different concentrations of test samples on Superoxide anion（·O2-）

2.1.4螺旋藻對(duì)DPPH有機(jī)自由基的清除效果

螺旋藻對(duì)DPPH有機(jī)自由基的清除效果見(jiàn)圖8。

圖8　不同濃度的測(cè)試樣品對(duì)DPPH有機(jī)氮自由基的清除效果圖Fig.8　Scavenging effect of different concentrations of test samples on organic nitrogen radicals（DPPH）

2.2螺旋藻對(duì)不同自由基清除作用的分析

由圖1、圖2、圖3、圖4可以看出，螺旋藻對(duì)不同種自由基均表現(xiàn)了較好的清除能力。將螺旋藻對(duì)不同自由基的清除率作圖分析，見(jiàn)圖9。

圖9　螺旋藻在不同濃度下對(duì)不同自由基的清除率Fig.9　The radical scavenging rate of spiraling in different concentrations

由圖5～圖9可以看出鈍頂螺旋藻不僅對(duì)不同自由基有較好的清除作用，而且隨著濃度的增加，清除的效率也在提高。螺旋藻在40 mg/mL時(shí)對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用達(dá)到了90%，對(duì)DPPH有機(jī)自由的清除作用達(dá)到了97%。

3　結(jié)論

隨著年齡增長(zhǎng)，機(jī)體內(nèi)自由基水平呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但由于機(jī)體老化，自由基清除機(jī)制卻逐步退化，結(jié)果造成體內(nèi)自由基大量積聚[7]。由此自由基對(duì)機(jī)體的健康危害日益加重，引發(fā)了多種生理功能的障礙，促進(jìn)多種老年疾病的發(fā)生發(fā)展，導(dǎo)致機(jī)體的衰亡。近年來(lái)有大量資料表明這些細(xì)胞的衰老、死亡，許多屬于自由基引發(fā)的細(xì)胞凋亡[8]。

針對(duì)幾種常見(jiàn)的自由基，運(yùn)用ESR法直接測(cè)試螺旋藻的抗氧化能力[9]，也較好地反映螺旋藻對(duì)不同自由基的清除能力。進(jìn)一步說(shuō)明了鈍頂螺旋藻粉具有降血脂、抗腫瘤[10]、抗病毒、抗輻射、抗凝血、抗氧化及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等生物活性[11]。

運(yùn)用ESR（順磁共振）法可以直接對(duì)鈍頂螺旋藻粉進(jìn)行測(cè)試，而不需要對(duì)其進(jìn)行烘干、研磨、提取等繁瑣步驟，不會(huì)破壞其自身的成分，更能直觀地表現(xiàn)其抗氧化能力。相比其他的紫外分光光度計(jì)方法，酶聯(lián)免疫法具有較大優(yōu)勢(shì)，減少了處理步驟，避免了鈍頂螺旋藻粉里活性物質(zhì)的丟失，更能真實(shí)地反映其的抗氧化能力。另外該方法快速靈敏，可用于其它食品的研究。另外，國(guó)際上已經(jīng)將抗氧化檢測(cè)用于抗衰老保健食品的評(píng)價(jià)[12]，對(duì)保健食品的開(kāi)發(fā)具有重要的作用與意義。此次研究對(duì)于開(kāi)發(fā)以螺旋藻為原料的保健食品或新藥具有一定指導(dǎo)意義。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.023

收稿日期：2014-07-16

作者簡(jiǎn)介：趙淑銳（1983—），女（漢），主管技師，碩士，研究方向：大型儀器分析在食品和藥品中的應(yīng)用。

Investigation with ESR on the Radical Scavenging Effect of Spirulina in Vitro

ZHAO Shu-rui，ZHENG Mei-qing，WU Ying-ting，XUE Bing
（Medical Experiment and Test Center，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Abstract：Organic nitrogen radicals，hydroxyl radicals（·OH），nitric oxide（NO）radicals，superoxide anion radicals（·O2-）were produced by DPPH，F(xiàn)enton reaction，SNAP，oxidation reaction of xanthine and xanthine oxidase.The antioxidant activities of spirulina in different concentrations were determined by the four radicals scavenging activity using electron paramagnetic resonance（ESR）Technology.The method was simple and easy to observe the results.Experimental results showed that spirulina have strong free radical scavenging capacity.The free radicalscavenging capacitywasincreasedby increasing concentrations.when the concentration in 40 mg/mL，

the scavenging rates of Superoxide anion and organic nitrogen radicals reached more than 90%.

Key words：spirulina；DPPH；hydroxyl（OH）radicals；nitric oxide（NO）radicals；superoxide anion；elec