王姣斐，陳　野，陳遠平（.武警杭州士官學(xué)校軍需系，浙江杭州30023；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

離子交換層析分離純化發(fā)酵米糠中的Y-氨基丁酸

王姣斐1，陳野2，*，陳遠平1
（1.武警杭州士官學(xué)校軍需系，浙江杭州310023；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

摘要：以米曲霉發(fā)酵處理的米糠為研究對象，研究發(fā)酵米糠中γ-氨基丁酸的分離純化方法，采用超聲波輔助提取對米糠發(fā)酵物進行初步提取，然后采用離子交換層析法進行純化，提取液經(jīng)過離心、脫色、脫鹽等預(yù)處理，通過靜態(tài)吸附實驗和吸附動力學(xué)試驗確定離子交換層析的最適條件。結(jié)果表明，選取732型強酸性陽離子交換樹脂、上樣pH為3.0、上樣液濃度2 mg/mL，流速2 mL/min，洗脫液pH 8.0～10.0，收集餾分，測得其γ-氨基丁酸的純度為73%，計算得提取純化γ-氨基丁酸的得率為44.9%。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵米糠；γ-氨基丁酸；離子交換層析；分離純化

γ-氨基丁酸是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，是由谷氨酸通過谷氨酸脫羧酶的作用發(fā)生脫羧反應(yīng)而生成[1-2]。免疫學(xué)研究表明，γ-氨基丁酸是人體中樞神經(jīng)一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有極為重要的生理功能[3-4]，在促進大腦活性、健腦益智、抗癲癇、促進睡眠、美容潤膚、延緩腦衰老機制、降血壓[5]等方面作用明顯，同時還具有改善腎機制、抑制脂肪肝及肥胖癥[6]、促進肝功能[7]等作用。目前γ-氨基丁酸的制備方法主要有植物富集法和微生物發(fā)酵法[8-10]，運用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-氨基丁酸是通過微生物自身酶系的脫羧作用來提高米糠中γ-氨基丁酸的含量[11]。

米糠是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中重要的加工副產(chǎn)品[12]，米曲霉是食品工業(yè)中常見的微生物，主要用于生產(chǎn)醬油及一些生物活性物質(zhì)，具有良好的蛋白酶活性[13-14]，這些都為以米糠作為原料生產(chǎn)γ-氨基丁酸提供了理論基礎(chǔ)。本研究的研究對象是米曲霉發(fā)酵后的預(yù)處理米糠，主要采用超聲波輔助法和離子交換層析法對發(fā)酵米糠中的γ-氨基丁酸進行分離純化，研究分離純化條件對γ-氨基丁酸產(chǎn)率的影響，為今后的規(guī)模化生產(chǎn)提供理論和試驗支撐。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

γ-氨基丁酸標準品：美國Sigma公司；723型、734型、D001型陽離子交換樹脂：天津光復(fù)精細化工研究所；發(fā)酵米糠：天津科技大學(xué)食品加工與保鮮實驗室自制。

1.2儀器與設(shè)備

BS-100A型自動部分收集器：分析儀器廠有限公司；HL-2型恒流泵：上海亞榮生化儀器廠；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-3型循環(huán)水式多用真空泵：上海滬西分析儀器廠；Agilent C18色譜柱：美國Agilent儀器公司；D-2000 Elite型高效液相色譜儀：日立實驗儀器設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1發(fā)酵米糠γ-氨基丁酸的超聲波輔助提取

根據(jù)γ-氨基丁酸易溶于水的特性[15]，采用蒸餾水作為提取溶劑，采用超聲波輔助提取法，將發(fā)酵米糠在適量蒸餾水中浸泡30 min，使發(fā)酵物固體被提取液充分潤濕，設(shè)定發(fā)酵物與提取液之間適當(dāng)料液比、超聲時間和提取次數(shù)，得到發(fā)酵提取液，采用高效液相色譜法測定提取液中γ-氨基丁酸含量，研究不同料液比、超聲時間和提取次數(shù)對提取液中γ-氨基丁酸的含量的影響。

1.3.2發(fā)酵提取液的預(yù)處理

準確稱取50.000 g發(fā)酵物，加入適量蒸餾水，超聲提取30 min，混合物離心取上清液，濾渣與適量蒸餾水混勻，超聲輔助提取30 min，合并收集兩次提取上清液，定容至500 mL容量瓶。上清液60℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮至200 mL，加入4 g活性炭，勻速攪拌10 min，然后在80℃保溫20 min。溶液用濾紙過濾，并用蒸餾水反復(fù)洗滌濾液兩次，合并濾液60℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮至60 mL，濃縮的溶液加入140 mL無水乙醇脫鹽，室溫下處理1 h。溶液過濾，60℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，蒸餾水定容至100 mL[16]。

1.3.3發(fā)酵提取液中γ-氨基丁酸的含量測定

發(fā)酵提取液中γ-氨基丁酸含量的測定采用鄰苯二甲醛（OPA）柱前衍生高效液相色譜法，具體色譜條件如下：

色譜儀：使用D-2000 Elite（Hitachi）系列高效液相色譜儀，紫外檢測器；

色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；

色譜條件：流動相：20%乙腈-20%甲醇-60%醋酸鈉緩沖液（pH7.2：NaAc·3H2O 1.6 g，色譜純甲醇200 mL，色譜純乙腈200 mL，加超純?nèi)ルx子水至1 L），柱溫40℃，檢測波長338 nm，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL。

1.3.4陽離子交換樹脂的選擇

本研究純化γ-氨基丁酸采用目前精制氨基酸應(yīng)用最廣泛的方法——離子交換層析法，采用陽離子交換樹脂作為分離介質(zhì)[17]。

表1　3種強酸性陽離子交換樹脂的基本性能指標Table 1　The basic performance indexs of the three strongly acidic resin

1.3.5陽離子交換樹脂的制備[18]

將150 mL樹脂置于潔凈的燒杯中，用溫水反復(fù)漂洗，直至排水清晰為止，用蒸餾水浸泡樹脂12 h，然后抽干水分，重復(fù)上述過程2次，使樹脂充分膨脹。用300 mL 1 mol/L的鹽酸溶液浸泡樹脂2 h～4 h，并不時攪拌。然后用蒸餾水洗滌，至吸出液的pH接近4.0。隨后用300 mL 1 mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡6 h～12 h，并用蒸餾水沖洗至pH為略堿性，再用300 mL 1 mol/L的鹽酸溶液處理，使樹脂變?yōu)闅湫?，最后用蒸餾水洗至pH為4.0，并且無氯離子存在。

1.3.6靜態(tài)吸附試驗[19]

1.3.6.1吸附量的測定

準確稱取已經(jīng)過預(yù)處理的濕樹脂3.0 g，布式漏斗抽濾吸干表面水分，裝入250 mL錐形瓶中，準確加入一定濃度的米糠發(fā)酵提取液100 mL，調(diào)節(jié)pH為3.0，瓶口密封，在溫度為25℃，搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min條件下振蕩24 h，使發(fā)酵液中的γ-氨基丁酸充分吸附在樹脂，過濾，測定溶液中γ-氨基丁酸的濃度，同時測定初始發(fā)酵提取液中γ-氨基丁酸的濃度，按下式計算樹脂在相同條件下對發(fā)酵提取液中γ-氨基丁酸的吸附量。

1.3.6.2解吸率的測定

準確稱取按照上述方法充分吸附好的樹脂3.0 g，布式漏斗抽濾吸干表面水分，裝入250 mL錐形瓶中，準確加入濃度為1 mol/L的氨水溶液100 mL，瓶口密封，在溫度為25℃，搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min條件下振蕩24 h，過濾，高效液相色譜法測定濾液中γ-氨基丁酸的濃度，按照下式計算樹脂的解吸率。

1.3.6.3吸附時間對樹脂吸附容量的影響

準確稱取732陽離子交換樹脂5.0 g，吸干樹脂表面的水分，置于250 mL錐形瓶中，加入已知質(zhì)量濃度的米糠發(fā)酵提取液150 mL，密封瓶口，在溫度為25℃，搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min條件的搖床培養(yǎng)箱中振蕩，分別在吸附時間為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h時測定發(fā)酵提取液中γ-氨基丁酸的濃度，測定3次取平均值。

1.3.6.4上樣液pH對樹脂吸附容量的影響

取經(jīng)過預(yù)處理的發(fā)酵物提取液，分別調(diào)pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0，取適量經(jīng)預(yù)處理的樹脂與發(fā)酵物提取液混合，100 r/min振蕩24 h，使之完全吸附，高效液相色譜法測定吸附后提取液的γ-氨基丁酸含量，測定吸附量。

1.3.7動態(tài)吸附實驗[20]

1.3.7.1上樣濃度對樹脂動態(tài)吸附的影響

取適量預(yù)處理好的陽離子交換樹脂，布式漏斗抽濾除去表面水分，裝入玻璃層析柱中，分別取稀釋至濃度為0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、3.5 mg/mL的γ-氨基丁酸發(fā)酵提取液100 mL，以1 mL/min的上樣流速上樣，收集流出液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并稀釋定容至100 mL，測定流出液中γ-氨基丁酸的濃度，計算陽離子交換樹脂的吸附量。

1.3.7.2上樣流速對樹脂動態(tài)吸附的影響

取適量預(yù)處理好的陽離子交換樹脂，布式漏斗抽濾除去表面水分，裝入玻璃層析柱中，分別取稀釋至濃度為2 mg/mL的γ-氨基丁酸發(fā)酵提取液100 mL，以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL/min的上樣流速上樣，收集流出液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并稀釋定容至100 mL，測定流出液中γ-氨基丁酸的濃度，計算陽離子交換樹脂的吸附量。

1.3.8洗脫實驗

當(dāng)洗脫液的酸堿度不同時，γ-氨基丁酸的洗脫效果也不盡相同，將上述吸附好的陽離子交換樹脂層析柱分別加入pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的洗脫劑100 mL，收集流出液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并稀釋定容至100 mL，測定流出液中γ-氨基丁酸的濃度，計算陽離子交換樹脂的吸附量。

2　結(jié)果與討論

2.1γ-氨基丁酸標準曲線圖

γ-氨基丁酸標準曲線圖見圖1。

圖1　γ-氨基丁酸標準曲線圖Fig.1　Standard curve of GABA

將配制的不同濃度γ-氨基丁酸標準系列溶液衍生后分別吸取20 μL進樣，按選定的色譜條件進行分析，每個標品進樣3次，峰面積取平均值。在一定濃度范圍內(nèi)，γ-氨基丁酸的紫外吸收（可轉(zhuǎn)變?yōu)槟硶r刻出峰的峰面積大?。┡cγ-氨基丁酸濃度呈線性關(guān)系。以γ-氨基丁酸的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。通過回歸方程計算求得回歸方程y=0.022 8x-0.369，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 4，工作曲線如圖1所示。

2.2超聲波輔助提取條件優(yōu)化

超聲波輔助提取目前廣泛的應(yīng)用于各種生物活性物質(zhì)的分離提取和檢測前處理中，具有操作步驟少，提取效果好，節(jié)省能源，試驗時間短等眾多優(yōu)點，應(yīng)用前景廣闊。根據(jù)γ-氨基丁酸易溶于水的特性，采用蒸餾水作為提取溶劑，使用超聲波提取提取儀提高提取效率，研究料液比、超聲時間、提取次數(shù)對米糠發(fā)酵物中GABA含量的影響。料液比對發(fā)酵產(chǎn)物中GABA提取效果的影響見圖2。

由圖2的趨勢可以看出，隨著料液比的增加，米糠發(fā)酵提取液中γ-氨基丁酸的含量迅速增加，當(dāng)料液比達到1∶10（g/mL）時，提取液中γ-氨基丁酸含量的增速減緩并逐漸趨于穩(wěn)定。當(dāng)料液比過低時，米糠發(fā)酵物不能與提取液充分接觸，并且超聲提取的原理就是利用提取過程中水分子與物料顆粒之間的作用力來提高提取效率的，因此料液比增高有助于增強提取效果。然而如果料液比過高，提取液體積過大，增加提取量的效果相對不明顯，不利于γ-氨基丁酸提取液的后續(xù)濃縮和純化。綜合考慮成本和其他因素，確定最佳提取料液比為1∶10（g/mL）。超聲時間對發(fā)酵產(chǎn)物中GABA提取效果的影響見圖3。

圖3　超聲時間對發(fā)酵產(chǎn)物中GABA提取效果的影響Fig.3　Effect of the ultrasonic timeon GABA content in fermented product

由圖3可知，提取液中γ-氨基丁酸的含量隨著提取時間的延長當(dāng)而呈現(xiàn)增加趨勢，當(dāng)超聲時間達到30 min時達到最大提?。划?dāng)超聲時間小于40 min時，發(fā)酵物提取液中γ-氨基丁酸的含量趨于穩(wěn)定，當(dāng)提取時間大于40 min時，γ-氨基丁酸的含量呈現(xiàn)緩慢的下降趨勢，這可能是由于超聲時間過長，超聲儀中提取液溫度上升，加之超聲作用，不利于提取液中γ-氨基丁酸的穩(wěn)定，因此選取超聲輔助提取時間為30 min。與傳統(tǒng)的熱水浸提法相比，超聲波輔助提取具有較大的優(yōu)勢，這一提取過程中機械作用和空化作用相互協(xié)同[21]，增大了水分子和物料分子之間的運動頻率和速度，并且增強了溶劑穿透能力，可以大大地縮短提取時間，從而提高了γ-氨基丁酸的溶出速度和含量。

當(dāng)進行固體的液體超聲提取時，為了提高提取效率，一般需要進行分步提取。提取次數(shù)對發(fā)酵產(chǎn)物中GABA提取效果的影響見圖4。

圖4　提取次數(shù)對發(fā)酵產(chǎn)物中GABA提取效果的影響Fig.4　Effect of the extraction timeson GABA content in fermented product

由圖4可以看出，發(fā)酵物提取液中γ-氨基丁酸的含量隨著提取次數(shù)的增加呈現(xiàn)先增大后趨于穩(wěn)定的趨勢。提取次數(shù)對發(fā)酵物提取液中γ-氨基丁酸含量的影響顯著，前3次提取效果比較明顯，當(dāng)繼續(xù)進行第4次、第5次提取時，γ-氨基丁酸的含量變化不大，說明此時已經(jīng)沒有更多的γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)移到提取液中，提取已經(jīng)基本完全。而且提取次數(shù)過多不僅會提高試驗成本，而且會造成得到的提取液體積過大，不利于γ-氨基丁酸提取液的后續(xù)濃縮和純化。因此選擇提取次數(shù)3次最為合適。

2.3離子交換層析對γ-氨基丁酸的純化

2.3.1樹脂的選取和制備

根據(jù)離子交換層析的主要原理和有關(guān)發(fā)酵液中γ-氨基丁酸的純化相關(guān)文獻可知[22]，與其他類型的樹脂相比，強酸型陽離子交換樹脂對γ-氨基丁酸的靜態(tài)交換容量較大，因此本試驗選取了732型、734型和D001型3種陽離子交換樹脂作為研究對象。三種陽離子交換樹脂的靜態(tài)吸附容量見圖5。

圖5　三種陽離子交換樹脂的靜態(tài)吸附容量Fig.5　Static capacity of three kinds of ion-exchange resins

由圖5可以看出，3種陽離子交換樹脂的靜態(tài)吸附容量都比較大，均超過了20 mgGABA/g樹脂，其中734型樹脂吸附容量較低，732型和D001型陽離子交換樹脂吸附容量較高。這兩種樹脂中732型屬于凝膠型樹脂，D001型屬于大孔型樹脂，一般來說大孔型樹脂具有強度大，離子擴散速度快，使用時效率高，所需處理時間縮短等特點，但吸附量往往不如凝膠型樹脂。732型凝膠樹脂具有價格低廉，吸附量大，吸附速度快等特點，因此選取732型強酸性陽離子交換樹脂進行后續(xù)試驗。李向平等[22]的研究比較001×7、001×4、D001、S-9、S604、201×7、117、D113和D204等7種不同類型的樹脂對γ-氨基丁酸的靜態(tài)吸附容量，研究發(fā)現(xiàn)弱酸型陽離子交換樹脂和強堿型陰離子交換樹脂的交換容量比較小，而強酸型陽離子交換樹脂的靜態(tài)吸附容量普遍較大，與本研究的結(jié)論一致。該研究測得交換容量達到1.6 mmol/g樹脂以上，比本研究測定得到的交換容量稍高，且D001型樹脂的交換容量比732型樹脂交換容量大，與本研究略有不同。分析原因可能在其測定γ-氨基丁酸的靜態(tài)吸附容量是以γ-氨基丁酸標準溶液作為吸附溶液，而本試驗是采用預(yù)處理后的米糠發(fā)酵物提取液，這兩種試驗方法各有千秋，采用γ-氨基丁酸標準溶液在測定吸附前后γ-氨基丁酸濃度變化時，結(jié)果較為準確，計算得到的靜態(tài)吸附容量更精確，但并不能完全代表樹脂對實際發(fā)酵液的吸附情況；本研究采用預(yù)處理后的米糠發(fā)酵物提取液進行試驗，測定吸附前后γ-氨基丁酸濃度變化不如前者精確，但更能夠預(yù)測出不同類型樹脂在特定發(fā)酵提取液中的吸附容量，因為發(fā)酵提取液中還可能存在其他雜質(zhì)氨基酸，可能會對陽離子交換樹脂對γ-氨基丁酸的吸附造成競爭，這也是本研究測定吸附容量略低的原因。

2.3.2732型樹脂吸附量和解析率的測定

由2.3.1試驗結(jié)果，可以得到732型陽離子交換樹脂的吸附量為34.3 mg/g樹脂。用100 mL NH3·H2O解吸3.0 g充分吸附了GABA的樹脂，25℃振蕩處理24 h后過濾，測定濾液中GABA濃度，根據(jù)公式計算得出陽離子交換樹脂的解吸率為98.7%。黃懷生等[23]使用不同種類的陽離子交換樹脂分離純化茶葉中γ-氨基丁酸，在初始濃度1.608 mg/mL的條件下，測定吸附平衡后，樹脂的吸附量為42.9 mg/g，使用2/4NH3· H2O在室溫下進行解吸，測得解吸率為98.08%，與本研究結(jié)果基本一致。

2.3.3靜態(tài)吸附動力學(xué)試驗結(jié)果

吸附時間與靜態(tài)吸附量的關(guān)系試驗結(jié)果如圖6所示。

圖6　吸附時間與靜態(tài)吸附量的關(guān)系Fig.6　Effect of absorption time on static capacityof resins

由圖6可以看出，隨著吸附時間的增加，吸附量先迅速增大，之后呈穩(wěn)定趨勢。陽離子交換樹脂在吸附開始的0.5 h之內(nèi)的吸附速度非?？欤炯航?jīng)達到其吸附總量的70%，在2 h以后，吸附量基本趨于穩(wěn)定。732樹脂的吸附速度很快，并且吸附量也較大，2 h左右即可基本實現(xiàn)完全吸附。這與文獻[23]中732陽離子交換樹脂在5 h后吸附已經(jīng)超過了90%的研究結(jié)果基本一致。綜合吸附量、解吸率和吸附速率這3個因素考慮，可以看出732樹脂是比較適合分離純化米糠發(fā)酵提取液中的γ-氨基丁酸的。上樣液pH對樹脂GABA吸附量的影響見圖7。

圖7　上樣液pH對樹脂GABA吸附量的影響Fig.7　Effect of pH on static capacityof resins

從圖7中可以看出，交換樹脂的γ-氨基丁酸吸附量隨著上樣液pH的變化呈現(xiàn)劇烈的變化，吸附量首先快速增大，并且在pH為3.0時達到最大，之后呈現(xiàn)下降趨勢，當(dāng)提取液的pH下降到7.0時，樹脂的γ-氨基丁酸吸附量已經(jīng)下降到5 mgGABA/g樹脂以下。由此可知酸性提取液有助于樹脂的良好吸附，這是因為GABA本身就是一種氨基酸，同時帶有堿性基團，因此在酸性環(huán)境中氨基易結(jié)合一個質(zhì)子而成陽離子狀態(tài)，容易被樹脂吸附[24]。由上圖可知，要達到較好的吸附效果，應(yīng)當(dāng)使上樣液pH控制在3.0左右。

2.3.4離子交換樹脂吸附動力學(xué)試驗結(jié)果

離子交換樹脂吸附動力學(xué)試驗結(jié)果見圖8。

圖8　上樣液GABA質(zhì)量濃度對交換樹脂動態(tài)吸附的影響Fig.8　Effect of GABA mass concentration on static capacityof resins

由圖8可知，交換樹脂動態(tài)吸附量隨著提取液質(zhì)量濃度的增大呈上升趨勢，當(dāng)γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度在2 mg/mL以下時，吸附量的上升速度很快；當(dāng)提取液的質(zhì)量濃度大于2 mg/mL時，吸附量的增速減緩并趨于穩(wěn)定。雖然提取液的質(zhì)量濃度越大，樹脂吸附量隨之增大，但提取液質(zhì)量濃度過大，不僅會增大提取液預(yù)處理時旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時的工作量，而且不利于控制成本，因此本研究選擇上樣液質(zhì)量濃度控制在2 mg/mL較為合適。上樣液流速對交換樹脂動態(tài)吸附的影響見圖9。

圖9　上樣液流速對交換樹脂動態(tài)吸附的影響Fig.9　Effect of flow velocities on static capacityof resins

由圖9可知，交換樹脂動態(tài)吸附量隨著流速的增加而減小，流速為1 mL/min的時候吸附量為最佳，但是如果上樣流速過低導(dǎo)致實驗周期延長，因此綜合考慮試驗便捷性和吸附量隨上樣流速的降低程度，本研究選擇上樣流速為2 mL/min。

2.3.5洗脫實驗結(jié)果

不同pH的洗脫液對GABA的洗脫程度不同，將上述吸附好的樹脂層析柱分別加入pH為5.0、6.0、7.0 的100 mL檸檬酸緩沖液和pH為8.0、9.0、10.0和11.0 的100 mL NH3·H2O進行洗脫。堿性條件下GABA中的羧基電離出一個質(zhì)子而帶負電荷，呈陰離子狀態(tài)，從而使陽離子交換樹脂的吸附量大大降低，以此達到解吸附的目的。洗脫液pH對洗脫效果的影響見圖10。

圖1　0　洗脫液pH對洗脫效果的影響Fig.10　Effect of eluent pH on the degree of elution

由試驗可以看出，當(dāng)洗脫液為酸性時，洗脫液中幾乎檢測不到GABA的存在，當(dāng)洗脫液的pH逐漸上升到堿性時，洗脫液中的GABA濃度開始上升，在pH=8.0～10.0時，洗脫效果最佳。

取經(jīng)過預(yù)處理的發(fā)酵物粗提液200 mL，調(diào)節(jié)其γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度約為2.0 mg/mL，調(diào)pH為3.0，上樣流速2 mL/min，將粗提液勻速上樣到裝有陽離子交換樹脂的層析柱上，上樣完成后用300mL蒸餾水以1mL/min的流速沖洗，再用150mL0.1mol/L的氨水以1mL/min的流速沖洗，以便除去其他吸附在層析柱中可在酸性和中性洗脫劑中洗脫的雜質(zhì)氨基酸。沖洗完成后用1 mol/L氨水溶液作為洗脫劑，2 mL/min的流速勻速通過層析柱，并實時測定洗脫液的pH，收集pH 8～11的洗脫液，分裝各小試管，分別測定其γ-氨基丁酸含量，取γ-氨基丁酸含量大于60%的組分。洗脫過程中，使用蒸餾水和0.1 mol/L的氨水可以將提取液中的非特異性雜質(zhì)除去。為了把γ-氨基丁酸從樹脂中解吸出來，需要減弱帶電粒子間的相互作用力，這通常是通過增加離子強度或增大pH從而降低電荷作用力或改變γ-氨基丁酸的極性來實現(xiàn)的[16]。如果使用第一種方法洗脫，那么就會引入新的無機鹽到γ-氨基丁酸提取液中，從而偏離了獲得高純度γ-氨基丁酸的目的。作為有效且價格低廉的試劑，氨水可以很容易的增大體系的pH，并且很容易從溶液中去除，因此使用氨水作為洗脫劑從樹脂中洗脫γ-氨基丁酸。各管洗脫液體積及γ-氨基丁酸含量見表2。

表2　各管洗脫液體積及γ-氨基丁酸含量Table 2　The valume and GABA content of different collect liquid

由表2可知，收集γ-氨基丁酸含量大于60%的餾分，混合并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氨水，待旋蒸體積不變時，用蒸餾水將濃縮液定容至10 rnL，測得其γ-氨基丁酸的濃度為17.9 mg/rnL，純化提取物中γ-氨基丁酸的純度為73.1%，由此計算得到本研究中離子交換層析法純化γ-氨基丁酸的得率為44.9%。提取液純化前的液相色譜圖見圖11和圖12。

圖1　1　提取液純化前的液相色譜圖Fig.11　High performance liquid chromatogram of fermented liquid before extraction and purification

由圖12可以看出，經(jīng)過純化后γ-氨基丁酸的特征色譜峰十分明顯，色譜圖中雜峰的干擾較之純化前有了明顯的減少，說明離子交換層析對發(fā)酵物提取液中γ-氨基丁酸的純化有一定的效果。同時我們也注意到，在5.5 min處有一較為明顯的雜峰干擾，這可能是發(fā)酵物提取液中存在的谷氨酸沒有完全除去，后續(xù)實驗我們會繼續(xù)優(yōu)化純化條件，改進實驗方法以得到更好的試驗結(jié)果。

圖1　2　提取液純化后的液相色譜圖Fig.12　High performance liquid chromatogram of fermented liquid after extraction and purification

3　結(jié)論

本研究采用超聲波輔助提取對發(fā)酵米糠進行初步提取，然后采用離子交換層析法進行純化，提取液經(jīng)過離心、脫色、脫鹽等預(yù)處理，通過靜態(tài)吸附試驗和吸附動力學(xué)實驗確定離子交換層析的最適條件。結(jié)果表明，選取732型強酸性陽離子交換樹脂、上樣pH為3.0、上樣液濃度2 mg/mL，流速2 mL/min，洗脫液pH 8.0～10.0，收集餾分，測得其γ-氨基丁酸的純度為73%，計算得提取純化γ-氨基丁酸的得率為44.9%。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.016

收稿日期：2015-07-05

作者簡介：王姣斐（1989—），女（漢），助教，碩士，研究方向：飲食營養(yǎng)與食品衛(wèi)生，食品加工。

*通信作者：陳野（1968—），男（漢），教授，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及農(nóng)產(chǎn)品副產(chǎn)物生物學(xué)轉(zhuǎn)化技術(shù)。

Ion-exchange Chromawgraphy Separeted and Purified γ-aminobutyric Acid from Fermentation Rice Bran

WANG Jiao-fei1，CHEN Ye2，*，CHEN Yuan-ping1
（1.Hangzhou Sergeant School of CAPF，Hangzhou 310023，Zhejiang，China；2.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract：Rice Bran fermented by Aspergillus oryzae was as the object of study，the methods of separation and purification of gamma aminobutyric acid of fermented rice bran was researched.The ultrasonic extraction was used to separation GABA from rice bran and GABA purification was conducted by successive centrifugation，filtration，decoloration，desalination and ion-exchange chromatography（IEC）.Results showed that the selected 732 strong acid cation exchange resin，the sample pH value was 3 and sample concentration，2 mg/mL，flow rate of 2 mL/min，eluent pH 8-10 fractions were collected.The recovery rate for the wholepurification process was about 44.9%.The purified product was characterized by HPLC，and its purity reached about 73%.

Key words：fermantation rice bran；γ-Aminobutyric acid；Ion-exchange chromatography；separate and purify