池永紅，云雅光（包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014035）

SPE-HPLC檢測動(dòng)物源性食品中3種氟喹諾酮類藥物殘留

池永紅，云雅光
（包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014035）

摘要：以3種氟喹諾酮類抗菌藥物-諾氟沙星、環(huán)丙沙星，恩諾沙星為研究對象，結(jié)合固相萃取串聯(lián)高效液相色譜，建立動(dòng)物源性食品中3種分析物殘留的準(zhǔn)確、靈敏的分析方法。研究采用Cleanert S C18固相萃取小柱為基質(zhì)凈化柱，以Hypersil-ODS C18柱（4.6 mm×250 mm）為液相分離柱，0.05 mol/L H3PO4-三乙胺溶液（pH 2.4）∶乙腈為82∶18（體積比）為流動(dòng)相，流速0.8 mL/min，能夠達(dá)到基質(zhì)凈化和分析物富集、分離目的。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所建立的方法對3種氟喹諾酮類藥物的最低檢出限分別達(dá)到1.5、1.3、1.5 μg/L；對3個(gè)添加濃度下的雞肉、雞蛋、牛奶和牛肉等復(fù)雜食品樣品中3種分析物殘留的檢測也具有較高的準(zhǔn)確度（回收率>90.0%）和重現(xiàn)性（RSD<5.0%，n=3）。

關(guān)鍵詞：氟喹諾酮類藥物；固相萃取；高效液相色譜；檢測

肉類、奶類等動(dòng)物源性食品營養(yǎng)豐富，是人類獲取動(dòng)物蛋白的主要途徑。然而獸用藥物在畜牧和漁業(yè)生產(chǎn)過程中的不當(dāng)或非法使用，使動(dòng)物源性食品成為風(fēng)險(xiǎn)較高、隱患較多的食品之一。近年來，動(dòng)物源性食品中獸藥殘留日趨嚴(yán)重，成為影響其質(zhì)量的重要因素，嚴(yán)重威脅了人類的身體健康，也影響了相關(guān)產(chǎn)品出口貿(mào)易的進(jìn)行，極度制約了我國食品經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。

喹諾酮類藥物（Quinolones，QNs）是指人工合成的含有4-喹酮母核的一類抗菌藥物，臨床上主要治療細(xì)菌感染性疾病[1-4]。該類藥物通過抑制細(xì)菌體內(nèi)的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ和Ⅳ活性，進(jìn)而抑制DNA的復(fù)制起到殺滅細(xì)菌作用[5-6]。而氟喹諾酮類藥物（Fluoroquinolones，F(xiàn)QNs）由于在C6位上引入的F，從而大大提高了抗菌作用，對革蘭氏陽性菌、陰性菌、衣原體、支原體以及結(jié)合桿菌等均有明顯作用，逐漸成為QNs的主流[7-8]。

諾氟沙星（Norfloxacin，NOR）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIPRO）、恩諾沙星（Enrofloxacin，ENRO）是3種典型的FQNs藥物，也是目前獸醫(yī)臨床上用量最大、范圍最廣的抗菌藥物[9]。一般認(rèn)為，這3種藥物不滯留于動(dòng)物組織，但大劑量使用容易導(dǎo)致在生物體內(nèi)產(chǎn)生蓄積毒性和細(xì)菌耐藥性，并引發(fā)一系列不良反應(yīng)如神經(jīng)中毒、腎功能損傷、過敏反應(yīng)等[10-11]。因此，許多國家和組織等都將其列入限制使用的獸藥范圍，并制訂出相應(yīng)的最高殘留限量（MRL）[12]。美國已禁止在食用動(dòng)物養(yǎng)殖中使用FQNs；歐盟（EC）則規(guī)定恩諾沙星與環(huán)丙沙星在動(dòng)物肌肉、肝臟和腎臟中的最大殘留量之和分別為100、200和300 μg/kg。在我國，國家質(zhì)監(jiān)總局也規(guī)定了諾氟沙星、恩諾沙星在動(dòng)物肌肉、肝臟和腎臟中的MRLs值分別為100、200、300 μg/kg[13]。

高效液相色譜分析方法是目前針對動(dòng)物源性食品中FQNs殘留檢測的主要方法之一[14]，具有高準(zhǔn)確度、高靈敏度的特征。另一方面，由于動(dòng)物源性食品基質(zhì)復(fù)雜，本身存在較多脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，不利于其中痕量存在的FQNs藥物殘留的準(zhǔn)確測定，通常需要嚴(yán)格的樣品前處理過程。所以，針對動(dòng)物源性食品中FQNs殘留，尋找一種集基質(zhì)凈化、痕量有害物富集于一體的準(zhǔn)確、靈敏、快速的分析檢測方法具有重要的意義。

1　材料與方法

1.1主要儀器與試劑

高效液相色譜儀配熒光檢測器（LC20ARF10AXL）：Shimadzu，Japan；勻漿組織破碎機(jī)（AM-6，Japan）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Centrifuge 5804R）：德國Eppendorf公司；振蕩器（QL-901）：海門其林貝爾儀器制造有限公司；固相萃取柱（Cleanert S C18 100 mg，3 mL）：Agela Technologies公司；超純水系統(tǒng)（18.2 MΩ cm）：Water Pro watersystem，Labconco Corp.USA。

諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品：購于浙江國邦藥業(yè)有限公司；甲醇，乙腈（色譜純）等有機(jī)溶劑：購于天津化學(xué)試劑一廠。去離子水自制。

雞肉、魚肉、豬肉、雞蛋、牛奶、牛肉，購于本地超市。1.2液相色譜條件

高效液相色譜儀配熒光檢測器，激發(fā)波長EX：280 nm，發(fā)射波長EM：450 nm；色譜柱：Hypersil-ODS C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.05 mol/L H3PO4-三乙胺溶液∶乙腈（82∶18，體積比），用前超聲脫氣30 min，恢復(fù)到室溫，備用；流動(dòng)相流速：0.8 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL，無柱溫。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取諾氟沙星、環(huán)丙沙星及恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品各0.010 g，分別溶解于0.05 mol/L H3PO4溶液中，并定容到100 mL，搖勻即得100.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，4℃冷藏，儲(chǔ)存期1個(gè)月。

準(zhǔn)確量取3種標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液1.0 mL，用0.05 mol/L H3PO4稀釋定容至100 mL，即得1.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別量取5、10、25、50、100、200、250 μL 1.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液于定量瓶中，稀釋至1.0 mL，搖勻得到濃度為5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0、250.0 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4樣品前處理

準(zhǔn)確稱取粉碎的雞肉、魚肉、豬肉樣品各2.00 g分別置于25 mL離心管中，分別加入乙腈5.0 mL和0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.0）5.0 mL，漩渦振蕩，4 000 r/min離心5 min，取上清液備用；對所得的組織殘?jiān)貜?fù)提取一次。合并所得的上清液中加入20.0mL水飽和正己烷，充分搖勻，靜置分層，取下層萃取液（組織提取液）備用。

試驗(yàn)選用C18（100 mg，3 mL，300 A）固相萃取小柱作為基質(zhì)凈化柱。固相萃取柱用前依次用5.0 mL去離子水，5.0 mL乙腈進(jìn)行活化，取10.0 mL組織提取液以均勻流速（約0.5 mL/min）上樣，2.0 mL去離子水淋洗，以2.0 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液洗脫，恒定氮?dú)鈿饬鞔蹈?，乙腈?fù)溶至1.0 mL，上機(jī)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜條件優(yōu)化與選擇

試驗(yàn)檢測的3種氟喹諾酮類藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)中均有羧基和哌嗪環(huán)結(jié)構(gòu)，化學(xué)性質(zhì)上存在兩性特征。在研究中選用了酸性溶液（0.05 mol/L H3PO4溶液，pH 2.4）與乙腈（82∶18，體積比）為流動(dòng)相，并添加適量三乙胺作為掃尾劑改善峰形。同時(shí)由于鹽溶液與有機(jī)相混合時(shí)容易產(chǎn)生結(jié)晶，會(huì)使液相色譜儀管路堵塞。實(shí)驗(yàn)中以三乙胺調(diào)整磷酸溶液pH分別達(dá)到1.8～4.5，優(yōu)化pH對3種氟喹諾酮類藥物的分離情況。結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相pH在1.8～3.0范圍內(nèi)時(shí)，3種分析物的保留時(shí)間基本不變，且峰形對稱，分離效果良好。當(dāng)pH超過3.0時(shí)，恩諾沙星的峰形變寬，有明顯拖尾現(xiàn)象。結(jié)合其他文獻(xiàn)和研究，實(shí)驗(yàn)中采用低濃度磷酸-三乙胺（0.05 mol/L H3PO4溶液，pH 2.4）與乙腈（82∶18，體積比）混合溶液為流動(dòng)相，不僅能夠獲得良好的峰形，也能有效地避免鹽類的結(jié)晶。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照2.3所示方法配制不同濃度（X，μg/L）的3種分析物的標(biāo)準(zhǔn)工作液，并按實(shí)驗(yàn)所列色譜條件進(jìn)行分析測定，以保留時(shí)間（諾氟沙星：6.43 min；環(huán)丙沙星：8.82 min；恩諾沙星：12.06 min）定性（圖1），外標(biāo)法峰面積（Y）定量，可得3種分析物的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。

圖1　諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星3種氟喹諾酮類藥物的液相色譜圖Fig.1Chromatograms of three FQNs-NOR，CIPRO and ENRO

圖2　3種氟喹諾酮類藥物-諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　The standard curves of three FQNs-NOR，CIPRO and ENRO

試驗(yàn)中，3種氟喹諾酮類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：諾氟沙星：Y=31 719 X+36 7812（R2=0.995 8）；環(huán)丙沙星：Y=27 453 X+150 141（R2=0.998 7）；恩諾沙星：Y=448 665 X+407 300（R2=0.999 8）。3種目標(biāo)分析物都具有良好的分離度，峰面積與濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。以最低濃度5.0 μg/L的測試數(shù)據(jù)計(jì)算3倍信噪比求得檢出限為1.5μg/L（NOR），1.3μg/L（CIPRO），1.5 μg/L（ENRO）。

2.3實(shí)際樣品檢測

研究中以雞肉、雞蛋、牛奶、牛肉、魚肉、豬肉為代表動(dòng)物源性食品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，以考察所建立的基質(zhì)凈化方法及3種沙星類抗菌藥物檢測方法的實(shí)際應(yīng)用能力。準(zhǔn)確稱取的雞肉、雞蛋、牛肉、魚肉、豬肉樣品各2.0 g及牛奶2.0 mL，分別進(jìn)行諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星濃度為10、20、30 ng/g（或ng/mL）的梯度添加，每個(gè)濃度平行3個(gè)，樣品前處理過程如上所述?；|(zhì)提取液上機(jī)分析取峰面積根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算3種目標(biāo)分析物的濃度，以加入量與測得量之比計(jì)算回收率及變異系數(shù)。結(jié)果如表1所示。

表1　雞肉、雞蛋、牛奶、牛肉、魚肉、豬肉中三種氟喹諾酮類抗菌藥的檢測結(jié)果Table 1　Results of three FQNs detection in chicken muscle，eggs，milk，beaf，fish and pork samples

續(xù)表1　雞肉、雞蛋、牛奶、牛肉、魚肉、豬肉中三種氟喹諾酮類抗菌藥的檢測結(jié)果Continue table 1　Results of three FQNs detection in chicken muscle，eggs，milk，beaf，fish and pork samples

3　結(jié)論

本研究建立了固相萃取串聯(lián)高效液相色譜法測定動(dòng)物源性食品雞肉、雞蛋、牛奶、牛肉、魚肉、豬肉中諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的殘留。通過試驗(yàn)結(jié)果比較，確定了色譜條件及樣品前處理過程，使其達(dá)到良好分離。對于3種分析物的線性范圍在50.0 μg/L～500.0 μg/L時(shí)的相關(guān)系數(shù)大于0.99；選定的6種動(dòng)物源性食品中3種藥物殘留的加標(biāo)回收率均大于90.0%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.0%。該方法具有簡便、快捷、精密度和準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)，能夠滿足常見動(dòng)物源性食品中諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星檢測的技術(shù)要求。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.041

收稿日期：2015-07-22

作者簡介：池永紅（1980—），男（漢），講師，碩士，研究方向：食品發(fā)酵和食品檢測。

Determination of Three Fluoroquinolones in Animal-derived Food by Combining SPE with HPLC

CHI Yong-hong，YUN Ya-guang
（Baotou Light Industry Vocational Technical College，Baotou 014035，Inner Mongolia，China）

Abstract：An accurate and sensitive method for the detection of three fluoroquinolones-norfloxacin（NOR），ciprofloxacin（CIPRO），enrofloxacin（ENRO）residues in animal-derived food products was developed by combining solid-phase extraction with high performance liquid chromatography.The Cleanert S C18 solidphase extraction column was used for complex matrix purification and one Hypersil-ODS C18 column（4.6 mm× 250 mm）was employed for separation in liquid chromatography.The mobile phase consisted of 0.05 mol/L H3PO4was controlled pH at 2.4 by triethylamine and mixed with ACN at the ratio of 82∶18（volume ratio），and the flow rate controlled at 0.8 mL/min for the purpose of obtaining good substrate clean-up and analytes enrichment.Based on the obtained resluts，the detection limit of three chosen analytes achieved to 1.5 μg/L （NOR），1.3 μg/L（CIPRO），1.5 μg/L（ENRO）in the developed method，good recoveries in chosen chicken muscle，egg，milk and beef samples at three spiked levels of NOR，CIPRO and ENRO were obtained higher than 90.0%with RSD less than 5.0%（n=3），meaning that the developed method in this research was high accuracy and reproducibility.

Key words：fluoroquinolones；SPE；HPLC；detection