李善姬，梁承武，*，崔承弼，金玉姬，白雪松，段　琦（.吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林303；.延邊大學(xué)食品研究中心，吉林延吉3300）

分離提取

野生桑黃總黃酮提取工藝及其抗氧化作用的研究

李善姬1，梁承武1，*，崔承弼2，金玉姬1，白雪松1，段琦1
（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林132013；2.延邊大學(xué)食品研究中心，吉林延吉133002）

摘要：以野生桑黃中的總黃酮提取率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并以VC為對(duì)照，測(cè)定長(zhǎng)白山野生桑黃中總黃酮的抗氧化活性。結(jié)果表明，正交試驗(yàn)獲得的長(zhǎng)白山野生桑黃總黃酮提取的最佳工藝為乙醇濃度60%，料液比1∶50（g/mL），超聲功率80 W，提取時(shí)間40 min。此時(shí)總黃酮含量為84.51 mg/g，提取率為8.45%。

關(guān)鍵詞：野生桑黃；總黃酮；正交試驗(yàn)；抗氧化作用

桑黃為多孔菌科植物針層孔的子實(shí)體，生于樺、楊等樹(shù)干上，是一種珍貴的藥用真菌，在食品、藥品等領(lǐng)域具有很高的利用價(jià)值，廣泛分布于我國(guó)東北、華北、西北等地區(qū)[1]。桑黃主要成分為黃酮類(lèi)和多糖類(lèi)[2]，其生理活性的研究都集中在抗腫瘤，增強(qiáng)免疫力和肝保護(hù)作用[3-5]。桑黃黃酮的提取工藝多采用堿液提取法、熱水提取法、乙醇回流提取法，提取時(shí)間長(zhǎng)，效率低[6-8]，而超聲波法是近年來(lái)興起的一項(xiàng)新技術(shù)，廣泛用于中藥成分的提取，具有提取率高，提取時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，并且不會(huì)破壞其中的活性成分[9]。本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取法提取野生桑黃中的總黃酮，單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)獲得桑黃總黃酮的最佳提取工藝條件，并以VC為對(duì)照，通過(guò)測(cè)定桑黃總黃酮對(duì)羥自由基（OH·）及二苯代苦味?；诫伦杂苫―PPH·）的清除能力來(lái)判定其抗氧化活性，為更好地開(kāi)發(fā)和利用該資源提供技術(shù)參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

長(zhǎng)白山楊樹(shù)野生桑黃：購(gòu)自延吉長(zhǎng)白山特產(chǎn)經(jīng)營(yíng)部；無(wú)水乙醇、95%乙醇、蒸餾水、乙醚、氫氧化鈉，亞硝酸鈉，硝酸鋁，石油醚均為國(guó)產(chǎn)分析純；蘆丁對(duì)照品：中國(guó)藥品生物制品鑒定所鑒定，批號(hào)為100080—200707。

1.2儀器設(shè)備

FA1104N電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津；數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SHB-111A型循環(huán)式多用真空泵：上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；ZN-500A型高速中藥粉碎機(jī)：長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)中南制藥機(jī)械廠；超聲波清洗器：上海超聲儀器有限公司；202-1A型電熱恒溫干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg在60%乙醇中溶解，定容于100 mL容量瓶中，得到濃度為0.20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。采用文獻(xiàn)[11]的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用紫外分光光度計(jì)于510 nm處測(cè)定吸光度，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得出回歸方程。

1.3.2總黃酮含量測(cè)定

精確稱(chēng)取1 g桑黃干燥粉末于100 mL三角瓶中，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，用超聲波進(jìn)行充分提取，得濾液，趁熱抽濾，將所得的溶液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，放置常溫。準(zhǔn)確吸取2 mL溶液于25 mL容量瓶中，加入30%的乙醇溶液3 mL，精確加入5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加入10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min；加入4%NaOH溶液10.0 mL，用蒸餾水定容，搖勻，放置15 min，備用。以試劑空白為參比，用紫外分光光度計(jì)于510 nm處測(cè)定吸光度[10]。再將所得吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中求出濃度（mg/mL），然后用公式（1）和（2）分別計(jì)算總黃酮含量和總黃酮提取率。

總黃酮的含量/（mg/g）=（C×稀釋倍數(shù)×V）/m（1）

總黃酮的提取率/%=[（C×稀釋倍數(shù)×V）/（m×1 000）]× 100（2）

式中：C為樣品中總黃酮的濃度，（mg/mL）；稀釋倍數(shù)為25；V為原液體積100 mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3總黃酮單因試驗(yàn)與正交試驗(yàn)

以總黃酮提取效率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在維持另外提取條件不變的情況下，分別考察不同乙醇濃度，料液比、超聲時(shí)間、超聲提取功率對(duì)桑黃總黃酮提取率的影響。初始料液比為1∶30（g/mL），提取時(shí)間為40 min，提取功率為60 W。單因素的范圍分別設(shè)定為：乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%；料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）；超聲提取時(shí)間 20、30、40、50、60 min；提取功率50、60、70、80、90 W。根據(jù)前期單因素試驗(yàn)的結(jié)果，每個(gè)因素取3個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化。以總黃酮提取率為指標(biāo)，采用L9（34）正交表試驗(yàn)確定最佳提取條件正交試驗(yàn)因素水平表如表1。

表1　正交試驗(yàn)因素水平表Table 1　The Orthogonal test factor and levels

1.4桑黃總黃酮抗氧化活性的測(cè)定

野生桑黃中總黃酮對(duì)OH·的清除能力采用水楊酸捕獲法進(jìn)行測(cè)定[11]。

桑黃中總黃酮對(duì)有機(jī)自由基（DPPH）的清除作用按照文獻(xiàn)[12]所述方法進(jìn)行測(cè)定。

2　結(jié)果與討論

2.1乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

乙醇濃度對(duì)桑黃中總黃酮提取率的影響如圖1所示。

圖1　乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1　The effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

從圖1可知，總黃酮提取率隨著乙醇濃度的增加出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇濃度小于70%時(shí)，總黃酮的提取率隨著乙醇濃度的增加而緩慢增加，乙醇濃度為70%時(shí)，總黃酮的提取率達(dá)到最大值，即5.9%，當(dāng)乙醇濃度大于70%時(shí)，總黃酮提取率逐漸下降，因此超聲波提取桑黃總黃酮的最適乙醇濃度為70%。

2.2料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

料液比對(duì)桑黃中總黃酮提取率的影響如圖2所示。

圖2　料液比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2　The effect of ratio of solid to liquid on the extraction rate of total flavonoids

從圖2可知，總黃酮提取率隨著料液比的增加而出現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶40（g/mL）時(shí)總黃酮提取率為7.05%，達(dá)到最大值，此時(shí)提取效果最好，因此超聲波提取的最適料液比為1∶40（g/mL）。

2.3超聲提取時(shí)間對(duì)桑黃總黃酮提取率的影響

超聲提取時(shí)間對(duì)桑黃總黃酮提取率的影響如圖3所示。

圖3　超聲提取時(shí)間對(duì)桑黃總黃酮提取率的影響Fig.3　The extracting time on the extraction rate of total flavonoids

由圖3可知，桑黃總黃酮提取率隨著超聲提取時(shí)間的增加而出現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，當(dāng)提取40 min時(shí)提取率為7.18%，達(dá)到最大，提取效果最好，因此超聲波提取的最適提取時(shí)間為40 min。

2.4超聲提取功率對(duì)桑黃總黃酮提取率的影響

超聲提取功率對(duì)桑黃總黃酮提取率的影響如圖4所示。

圖4　超聲功率對(duì)桑黃總黃酮提取率的影響Fig.4　The extracting power on the extraction rate of total flavonoids

從圖4可知，桑黃總黃酮提取率隨著超聲提取功率的增加而出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在超聲功率為70 W時(shí)達(dá)到最大值即6.2%，效果最好，因此超聲波提取的最適功率為70 W。

2.5正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2　桑黃總黃酮超聲提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2　Results of ultrasonic extraction of total flavonoids oforthogonal experiment

續(xù)表2　桑黃總黃酮超聲提取正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2　Results of ultrasonic extraction of total flavonoids of orthogonal experiment

通過(guò)對(duì)正交試驗(yàn)極差R的分析結(jié)果表明，各因素對(duì)桑黃總黃酮提取率影響的大小為A>C>B>D，即乙醇濃度為最主要的影響因素，超聲提取時(shí)間次之，料液比和超聲提取功率對(duì)結(jié)果的影響較小。正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果顯示，桑黃總黃酮提取最佳工藝組合為A1B3C2D3，即乙醇濃度為60%，料液比為1∶50（g/mL），在超聲功率為80W條件下提取40 min。

2.6最佳條件驗(yàn)證

因?yàn)樽罴言囼?yàn)組合不在正交表內(nèi)，需要進(jìn)行最佳組合的驗(yàn)證性試驗(yàn)。按最佳組合A1B3C2D3的條件，即乙醇濃度為60%，料液比為1∶50（g/mL），在超聲功率為80 W的條件下對(duì)桑黃總黃酮進(jìn)行提取，提取時(shí)間為40 min。測(cè)得桑黃總黃酮含量為84.51mg/g，其提取率為8.45%，與正交試驗(yàn)中提取率為7.925%的最高工藝A1B3C3D3相比，提取率較為接近。表明該提取工藝合理，方案可行。

2.7桑黃總黃酮抗氧化活性的研究

2.7.1桑黃總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除作用

不同濃度的桑黃總黃酮和VC對(duì)DPPH自由基的清除作用如圖5所示。

圖5　野生桑黃黃酮對(duì)DPPH·的清除作用Fig.5　The DPPH·scavenging effects of Wild Phellinus Vanini flavonoids

由圖5可知，在不同濃度下，桑黃總黃酮和VC對(duì)DPPH·均有清除作用，且清除率都隨著濃度的增大而增大，桑黃總黃酮清除DPPH·的能力較VC強(qiáng)。

2.7.2水楊酸法測(cè)定抗氧化活性

不同濃度的桑黃總黃酮和VC對(duì)OH·的清除作用如圖6所示。

圖6　野生桑黃清除羥自由基的作用Fig.6　The scavenging effects of the Wild Phellinus Vanini flavonoids on OH·

由圖6可知，在不同濃度下，桑黃總黃酮和VC對(duì)OH·均有清除作用，桑黃總黃酮對(duì)OH·清除率隨著濃度的增大而增大，總體上桑黃總黃酮清除OH·的能力較VC強(qiáng)。

3　結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定各個(gè)單因素的最佳水平，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)確定了實(shí)驗(yàn)室超聲提取桑黃總黃酮的條件，結(jié)果表明，各因素對(duì)桑黃總黃酮提取率影響的大小為乙醇濃度為最主要的影響因素，超聲提取時(shí)間次之，料液比和超聲提取功率對(duì)結(jié)果的影響較小。最佳提取條件是乙醇濃度60%，料液比1∶50（g/mL），超聲功率80 W，提取時(shí)間40 min，桑黃總黃酮含量為84.51 mg/g，桑黃總黃酮提取率為8.45%。

體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，桑黃中黃酮類(lèi)化合物對(duì)DPPH·和OH·均具有較強(qiáng)的清除能力，即桑黃黃酮類(lèi)化合物具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，且抗氧化活性較VC強(qiáng)，為日后天然抗氧化劑和功能性食品的開(kāi)發(fā)提供了技術(shù)參考。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.010

收稿日期：2014-05-24

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31160314）

作者簡(jiǎn)介：李善姬（1969—），女（朝鮮），副教授，博士，主要從事食品營(yíng)養(yǎng)與生理活性研究。

*通信作者：梁承武（1968—），男（朝鮮），教授，博士。

Study on Extraction Technology and Antioxidant Activity of Total Flavonoid from Wild Phellinus Vanini

LI Shan-ji1，LIANG Cheng-wu1，*，CUI Cheng-bi2，JIN Yu-ji1，BAI Xue-song1，DUAN Qi1
（1.Jilin Medical College，Jilin 132013，Jilin，China；2.Food Research Centre，Yanbian University，Yanji 133002，Jilin，China）

Abstract：The objects of this study were to optimize extraction technology and to research in vitro antioxidant activity of total flavonoids from wild phellinus vanini.The extraction process was optimized by single factor experiment and orthogonal design L9（34）and the antioxidant effect was determined with VCas positive control. The results had indicated that the extraction optimum technological conditions were the solid-liquid ratio 1∶50（g/mL），the concentration of ethanol 60%，the extracting time 40 minutes and the extracting power 80 W，and the total flavonoids content was 84.51 mg/g，the extraction rate was 8.45%.

Key words：wild phellinus vaninin；total flavonoids；orthogonal design；antioxidant activity