戴　帥，李建生，許戈良，莢衛(wèi)東，馬金良，劉文斌

Cripto-1在肝癌中的表達(dá)及與侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系

戴帥，李建生，許戈良，莢衛(wèi)東，馬金良，劉文斌

摘要目的檢測Cripto-1蛋白在不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞株、肝癌及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)水平，探討Cripto-1蛋白的表達(dá)與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移能力之間的關(guān)系。方法采用Western blot方法檢測不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞株、肝癌及相應(yīng)癌旁組織中Cripto-1的蛋白表達(dá)水平；采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測肝癌組織中Cripto-1蛋白的表達(dá)并探討與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果與癌旁肝組織相比，肝癌組織中Cripto-1的蛋白表達(dá)水平明顯升高。Cripto-1蛋白在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平與細(xì)胞株的侵襲潛能呈正比。與正常肝組織（0%）比較，Cripto-1在肝癌組織（64．6%）中高表達(dá)，且與腫瘤分化程度、血管侵犯和轉(zhuǎn)移狀態(tài)有相關(guān)性（P＜0．05）。結(jié)論Cripto-1蛋白在肝癌中高表達(dá)，并且其表達(dá)量與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞肝細(xì)胞癌；畸胎瘤衍生生長因子；侵襲；轉(zhuǎn)移

2015-06-26接收

李建生，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lijiansheng1953＠163．com肝癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤，低手術(shù)切除率和術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移使其成為病死率最高的惡性腫瘤之一，所以對肝癌侵襲轉(zhuǎn)移方面的研究成為當(dāng)前肝癌研究的熱點［1］。Cripto-1又稱畸胎瘤衍生生長因子TDGF-1，屬于EGF-CFC基因家族成員，是一種在胚胎干細(xì)胞中表達(dá)并對其維持自我更新能力至關(guān)重要的調(diào)控基因。研究［2］顯示Cripto-1的表達(dá)在多種腫瘤中重新出現(xiàn)，并調(diào)控腫瘤的增殖、侵襲、血管生成和內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等重要事件。因此，研究Cripto-1在肝癌中的表達(dá)及與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，對探索肝癌的惡性進(jìn)展機(jī)制以及尋找肝癌治療的新靶點具有重要意義。

1　材料與方法

1．1肝癌標(biāo)本W(wǎng)estern blot所使用新鮮標(biāo)本：選擇2013年10月～2014年3月于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院肝臟外科行手術(shù)切除的肝癌病例共14例，癌腫切除后立即刀片切取新鮮肝癌組織（選自癌組織邊緣非壞死組織）、癌旁組織（選自癌腫與正常組織交界處2 cm以內(nèi)），盡快-80℃條件保存?zhèn)溆?。全部病例的病理檢查均經(jīng)本院病理科診斷為肝細(xì)胞性肝癌。另選2例因非腫瘤原因（外傷、結(jié)石）行肝部分切除的正常肝組織作為對照。免疫組織化學(xué)染色所使用蠟塊標(biāo)本：選擇2006年1月～2011年1月于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院行切除術(shù)的且本院病理科診斷為肝細(xì)胞性肝癌的蠟塊標(biāo)本82例，另取10例因非腫瘤原因（外傷、結(jié)石）行肝部分切除的正常肝組織作為對照。所有病例術(shù)前均未行放化療等腫瘤相關(guān)治療，且均有完整的臨床病理資料。TNM分期遵從2002年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）第六次修訂標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。腫瘤分化程度遵從Edmondson分級法進(jìn)行分級。

1．2肝癌細(xì)胞株選取6株人肝癌細(xì)胞株Huh7、MHCC97-L、HepG2、MHCC97-H、HCCLM3、SK-Hep-1及一株正常肝細(xì)胞株L-O2。MHCC97-L、MHCC97-H及HCCLM3由肝膽胰外科安徽省重點實驗室提供。正常肝細(xì)胞株L-O2及肝癌細(xì)胞株Huh7、HepG2、SK-Hep-1購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1．3主要試劑胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)瓶、6孔板等耗材（美國Corning公司）；Western blot所使用全蛋白提取試劑盒（南京凱基公司），PVDF膜（美國Milipore公司），ECL試劑盒（江蘇碧云天公司）；Cripto-1、βactin抗體（美國Abcam公司）；免疫組織化學(xué)染色所使用SP試劑盒及DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物公司）。

1．4方法

1．4．1Western blot法測定Cripto-1蛋白表達(dá)根據(jù)凱基全蛋白提取試劑盒說明書操作提取組織和細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度；蛋白樣品混合上樣緩沖液后在沸水中加熱5 min，取40μg上樣，SDS-PAGE膠電泳分離蛋白；半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（0．22μm）上；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；TBST漂洗PVDF膜3次，浸入1∶500稀釋的Cripto-1抗體中4℃過夜；TBST洗膜3次，HRP二抗室溫孵育2 h；TBST洗膜3次后ECL化學(xué)發(fā)光顯影定影，曝光拍照；使用Image J軟件檢測條帶灰度值。

1．4．2免疫組織化學(xué)染色石蠟包埋切片標(biāo)本經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度酒精水化后，按抗體說明將切片浸入沸騰的0．01 mol／L枸櫞酸緩沖液中微波爐解凍檔加熱修復(fù)抗原，使用生物筆進(jìn)行組織圈定后滴加3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性10 min；PBS沖洗3次，滴加適量的Cripto-1抗體（1∶1 000稀釋）覆蓋切片，4℃條件下孵育過夜；PBS沖洗3次，滴加即用型二抗，室溫孵育1 h；PBS沖洗3次，滴加適量新鮮配置的DAB顯色液，顯微鏡下觀察控制顯色時間；滴加蘇木素染液染色約1 min，PBS沖洗；經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后鏡檢并拍照。結(jié)果判定由與本實驗無關(guān)的3位醫(yī)師盲法觀片并采用半定量計分法完成。每張切片隨機(jī)選取3～5個有效高倍視野（肝癌細(xì)胞占絕大多數(shù)），胞質(zhì)染色深度計分：無染色計0分、淡黃色計1分、棕黃色計2分、棕褐色計3分；陽性細(xì)胞百分比計分：無陽性細(xì)胞計0分、≤10%計1分、11%～50%計2分、＞50%計3分?？偡郑ㄈ旧疃扔嫹帧陵栃约?xì)胞百分比計分）0～4分為低表達(dá)（0分為陰性表達(dá)），5～9分為高表達(dá)。

1．5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料采用±s表示，采用獨立樣本的t檢驗和方差分析。率的比較采用X2檢驗或 Fisher精確概率法。

2　結(jié)果

2.1W estern blot檢測肝癌組織和肝癌細(xì)胞株中Crip to-1蛋白的表達(dá)量Western blot結(jié)果表明Cripto-1蛋白在肝癌組織［64．3%（9／14）］中的表達(dá)顯著高于與之配對的癌旁組織，見圖1。在正常肝細(xì)胞株L-O2細(xì)胞株中未發(fā)現(xiàn)Cripto-1蛋白的表達(dá)，而在3株高侵襲肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)明顯高于低侵襲肝癌細(xì)胞株的Cripto-1蛋白表達(dá)量，見圖2。MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM3人肝癌細(xì)胞株均是由MHCC97母細(xì)胞系連續(xù)篩選所得的轉(zhuǎn)移潛能遞增的細(xì)胞株，具有相似的遺傳背景。3株人肝癌細(xì)胞株中Cripto-1蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度的比值分別為0．317±0．036、0．562±0．052、0．689±0．076，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝34．941，P＜0．05）。以上結(jié)果表明Cripto-1蛋白在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)量與轉(zhuǎn)移潛能呈正比。

2.3免疫組織化學(xué)染色檢測肝癌組織切片中的Crip to-1蛋白的表達(dá)免疫組化染色結(jié)果顯示Cripto-1表達(dá)主要定位于胞質(zhì)，見圖3。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，Cripto-1在肝癌組織中的高表達(dá)率為64．6%（53／82），明顯高于正常組織中的0%（0／10）。Cripto-1在肝癌組織中的表達(dá)與腫瘤的血管侵犯、腫瘤分化程度及轉(zhuǎn)移情況相關(guān)（P＜0．05），而與患者性別、年齡、血清AFP水平、HBsAg狀態(tài)、肝硬化及腫瘤的大小、數(shù)目、包膜情況和TNM分級等無明顯相關(guān)性，見表1。

表1　Cripto-1在肝癌組織中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

3　討論

Cripto-1作為一種胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志物，對其維持多能性和自我更新能力至關(guān)重要。然而研究［3］顯示，Cripto-1的表達(dá)重新出現(xiàn)于多種人類腫瘤中，并且與多種人類常見腫瘤的組織病理分級密切相關(guān)，其中包括乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、膽囊癌、子宮內(nèi)膜癌等。在乳腺癌中，Cripto-1的表達(dá)明顯高于良性乳腺腫瘤，尤其在侵襲性乳腺導(dǎo)管癌和小葉癌中高表達(dá)。而且Cripto-1的表達(dá)與乳腺癌的孕激素受體表達(dá)情況、腫瘤組織分級密切相關(guān)［4］。本研究證明Cripto-1可能是一種非特異性的腫瘤標(biāo)志物，在肝癌中高表達(dá)而在非腫瘤肝組織中低表達(dá)或不表達(dá)，為肝癌的藥物靶向治療的研究指明了新的方向。另外其高表達(dá)與肝癌分化程度和侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，可能對肝癌的診斷和預(yù)后判斷提供一定的幫助。

課題組之前的研究［5］證實胚胎成形素Nodal在肝癌惡性進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用，在此基礎(chǔ)上本實驗繼續(xù)對Nodal的輔助受體Cripto-1進(jìn)行研究，證明Cripto-1在肝癌中高表達(dá)并且與肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。由此可以推測，Nodal／Cripto-1信號通路在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。Cripto-1作為TGF-β超家族配體（Nodal、GDF-1、GDF-2）的輔助受體，共同調(diào)控胚胎時期細(xì)胞的EMT過程，并使細(xì)胞獲得更強運動能力完成前后體軸和中-內(nèi)胚層形成以及器官發(fā)育不對稱性的建立［6］。在后天人體發(fā)育中，Cripto-1能夠通過激活EMT促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的運動，對乳腺的發(fā)育成熟具有重要意義［7］。并且有證據(jù)表明Cripto-1在乳腺癌和宮頸癌細(xì)胞株中過表達(dá)能增強腫瘤細(xì)胞的運動能力［8］。高表達(dá)Cripto-1的乳腺上皮細(xì)胞表現(xiàn)出EMT趨勢，并且伴隨Wnt／β-Catenin、c-src／AKT等信號的激活。Cripto-1作為胚胎發(fā)育階段的EMT誘導(dǎo)者，可能是通過EMT過程促進(jìn)肝癌獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力的。以上研究結(jié)果為繼續(xù)深入研究Cripto-1促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。

復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是肝癌研究的熱點，Cripto-1被證實在胚胎性癌、黑色素瘤和前列腺癌細(xì)胞株中一小群具有干細(xì)胞樣特性的細(xì)胞中表達(dá)［9-10］，高表達(dá)Cripto-1的細(xì)胞亞群可能是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的根源。所以深入研究Cripto-1在肝癌中的表達(dá)和促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有重要的臨床意義。

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Expression of Cripto-1 in hepatocellular carcinoma

Dai Shuai，Li Jiansheng，Xu Geliang，et al
（Dept of Hepatic Surgery，The Affiliated Provincial Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230001）

AbstractObjectiveTo evaluate expression of Cripto-1 protein in hepatocellular carcinoma（HCC），nontumorous liver tissues，and HCC cell lines with variousmetastatic potentials，and determine the correlation between the expression level and HCCmetastatic potential．MethodsWestern Blot was used to evaluate Cripto-1 protein expression in HCC tumor tissues，nontumorous liver tissues and HCC cell lineswith variousmetastatic potentials．Immunohistochemistry was used to evaluate Cripto-1 expression in HCC tumor tissues，and determine the correlation between the expression level and clinicopathologiacal parameters．Resu ltsExpression level of Cripto-1 protein was higher in HCC tissues than their paired adjacent nontumorous liver tissues as well as normal liver tissues．Cripto-1 protein expression was positively correlated with metastatic potential of HCC cell lines．High Cripto-1 expression was detected in 64．6% （53／82）of HCC tumor tissues，and 0（0／10）in the normal liver tissues．Clinicopathological analysis on 82 HCC patients demonstrated that Cripto-1 expression was significantly associated with tumor differentiation，vascular invasion and status ofmetastasis（P＜0．05）．ConclusionThe expression level of Cripto-1 protein is elevated in HCC，and positively correlated with the invasion and metastasis of HCC．

Key wordshepatocellular carcinoma；Cripto-1；invasion；metastasis

中圖分類號R 735．7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1645-04

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目（編號：81272398）；安徽高校省級科學(xué)研究項目（編號：KJ2012Z179）

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院肝臟外科，合肥230001

作者簡介：戴帥，男，碩士研究生；