李貴平，李維祖，段文婷，李衛(wèi)平，2

黃芪甲苷對(duì)高胰島素誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

李貴平1，李維祖1，段文婷1，李衛(wèi)平1，2

摘要目的研究黃芪甲苷（As-IV）對(duì)高胰島素誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞（HMCs）損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法以HMCs為研究對(duì)象，用MTT法檢測(cè)不同濃度胰島素作用不同時(shí)間后對(duì)HMCs增殖的影響，篩選胰島素的量效與時(shí)效關(guān)系；實(shí)驗(yàn)設(shè)正常組、高胰島素（64 nmol／L）組、二碘苯（DPI 10 μmol／L）組、抗氧化劑Tempol（100μmol／L）組、PI3K／Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002（10μmol／L）組與黃芪甲苷（As-Ⅳ25、50、100μmol／L）組。培養(yǎng)48 h后，MTT法檢測(cè)HMCs的細(xì)胞增殖狀況，DCFH-DA法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）含量，Western blot法檢測(cè)NADPH氧化酶4（NOX4）、磷酸化蛋白激酶B（p-PKB）（又稱p-Akt）、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果隨著濃度增加與作用時(shí)間延長(zhǎng)，胰島素對(duì)HMCs增殖有促進(jìn)作用且有量效與時(shí)效關(guān)系；與高胰島素組比較，DPI組、Tempol組、LY294002組與As-IV 25、50、100μmol／L組均能有效抑制高胰島素誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞內(nèi)ROS含量，降低NOX4、p-Akt、pmTOR蛋白的高表達(dá)（P＜0．05，P＜0．01）。結(jié)論胰島素呈時(shí)間和濃度依賴性促HMCs細(xì)胞增殖；As-IV對(duì)高胰島素誘導(dǎo)的HMCs有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制HMCs的過度增殖，減少細(xì)胞內(nèi)ROS生成，降低NOX4、p-Akt、p-mTOR蛋白高表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞高胰島素；人腎小球系膜細(xì)胞；黃芪甲苷；活性氧；磷酸化蛋白激酶B；磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕雷素靶蛋白

2015-06-25接收

2安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安慶246052

李衛(wèi)平，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lwp19＠126．com

高胰島素血癥（hyperinsulinism，HINS）是糖尿?。╠iabetesmellitus，DM）的常見臨床表現(xiàn)之一，既是1型糖尿病治療中的常見現(xiàn)象，也是2型糖尿病的重要特征。糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy， DN）作為DM的常見并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。HINS能夠促進(jìn)DN的發(fā)生發(fā)展，加重腎損傷［1-3］。黃芪甲苷（astragalosides IV，As-IV）是從豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根中分離的一種單體化合物，是黃芪發(fā)揮藥理作用的重要有效成分。研究［4-5］顯示，黃芪甲苷有抑制細(xì)胞肥大、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。該研究采用體外培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞（human mesangial cells，HMCs），根據(jù)文獻(xiàn)［6-7］，設(shè)計(jì)觀察1、2、4、8、16、32、64、128 nmol／L胰島素對(duì)HMCs細(xì)胞增殖的影響，并模擬HINSDM患者體內(nèi)的高胰島素環(huán)境，觀察高胰島素對(duì)HMCs以及As-IV對(duì)高胰島素處理的HMCs中NADPH氧化酶4（NADPH oxidase 4，NOX4）、磷酸化蛋白激酶B（phosphor-protein kinase b，p-PKB）（又稱p-Akt）、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（phosphor-mammalian targetof rapamycin，p-mTOR）蛋白表達(dá)、活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量的影響，探討HINS誘導(dǎo)DN發(fā)生發(fā)展及As-IV發(fā)揮保護(hù)作用的可能機(jī)制，從而為臨床上 DN的防治及 As-IV的應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1．1材料HMCs株（中南大學(xué)現(xiàn)代分析測(cè)試中心細(xì)胞室）；As-IV純度＞98%（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；牛胰島素、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二碘苯（DPI）、抗氧化劑Tempol、二甲基亞砜（DMSO）（美國(guó)Sigma公司）；PI3K／Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002（Abmole中國(guó)公司）；DMEM低糖培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青科技有限公司）；二氫二氯熒光素（2’，7’-Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；β-actin（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；NOX4（美國(guó)Santa Cruz公司）；p-Akt、p-mTOR（美國(guó)Bioworld公司）。

1．2方法

1．2．1細(xì)胞培養(yǎng)與分組將常規(guī)方法復(fù)蘇的HMCs培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基中。選取NADPH氧化酶特異性抑制劑DPI、強(qiáng)效抗氧化劑Tempol、PI3K／Akt信號(hào)通路特異性抑制劑LY294002作為陽性藥。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組如下：①正常組、胰島素組（分別含1、2、4、8、16、32、64、128 nmol／L胰島素）；②正常組、高胰島素（64 nmol／L）組、DPI（10μmol／L）組、Tempol（100μmol／L）組、LY294002（10μmol／L）組與As-IV（25、50、100 μmol／L）組；③正常組、高胰島素（64 nmol／L）組、DPI（10μmol／L）組、LY294002（10μmol／L）組與As-IV（25、50、100μmol／L）組；④正常組、高胰島素（64 nmol／L）組、Tempol（100μmol／L）組、LY294002（10 μmol／L）組與As-IV（25、50、100μmol／L）組。

1．2．2MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0．25%胰酶消化后，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋成單個(gè)細(xì)胞懸浮液。以2×104／孔密度接種于96孔板。24 h后細(xì)胞貼壁、展開完全，小心吸棄培養(yǎng)液，各孔均加入200μl無血清培養(yǎng)基饑餓24 h使其同步化。輕輕棄掉上清液，按1．2．1①、1．2．1②分組，每組各設(shè)6個(gè)復(fù)孔，給藥。1．2．1①繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h后，1．2．1②繼續(xù)培養(yǎng)48 h后每孔加入20μlMTT（5 mg／ml），避光，恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。4 h后小心棄掉上清液，每孔加入150μl DMSO，持續(xù)振蕩使藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解，10 min后于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度（optical density，OD）值。

1．2．3DCFH-DA法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS含量將單個(gè)HMCs懸浮液以3×105／孔密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。24 h后細(xì)胞貼壁、展開完全，小心吸棄培養(yǎng)液，各孔加入500μl無血清培養(yǎng)基饑餓24 h使其同步化。輕輕棄液，按1．2．1②分組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，給藥。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入不含血清、含10μmol／L DCFH-DA的培養(yǎng)基500μl，37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育20 min，每隔3 min或5 min搖晃混勻一次，使探針與細(xì)胞充分接觸。用無血清培養(yǎng)基洗滌各孔3次，以充分清除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA探針。熒光顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)不同區(qū)域拍照，采用IPP軟件分析3個(gè)視野內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度的平均值，再對(duì)各組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1．2．4Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NOX4、p-Akt、pmTOR蛋白的表達(dá)將單個(gè)HMCs懸浮液以4× 107／瓶密度接種于25 mm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。24 h后細(xì)胞貼壁、展開完全，棄掉培養(yǎng)液，加入5 m l無血清培養(yǎng)基饑餓24 h使其同步化。棄液，分組同1．2．1③、1．2．1④。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄液，用4℃預(yù)冷的PBS 5 m l洗2次，吸干瓶?jī)?nèi)液體后置于冰上。每瓶加入120μl裂解液，4℃搖床上充分裂解20～30 min后，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞并收集至1．5 m l EP管中。于4℃以12 000 r／min離心15 min。離心完畢后，收集上清液至500μl EP管中。BCA蛋白定量法測(cè)定各組蛋白含量。剩余蛋白以4∶1比例與5×上樣緩沖液充分混合均勻后，置于100℃金屬浴10 min以充分變性。于SDS-PAGE凝膠上電泳分離，其后電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上，PVDF膜用含5%脫脂奶粉的TBST于水平搖床上室溫封閉2 h。TBST洗后加入一抗 NOX4（1∶500）、p-Akt（1∶1 000）、pmTOR（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）置于4℃搖床上孵育過夜。TBST洗后加入辣根過氧化物標(biāo)記的二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h。TBST洗后用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。最后用Image J軟件分析灰度值。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1胰島素對(duì)HMCs細(xì)胞增殖的影響采用單因素方差分析進(jìn)行主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)（F值分別為12 h：3．59，24 h：3．78，48 h：7．72，P＜0．01）。LSD兩兩比較結(jié)果顯示，與正常組比較，體外培養(yǎng)12、24、48 h后的胰島素1、2、4、8、16、32、64、128 nmol／L組的OD值均有不同程度的上升，其中，12 h時(shí)，胰島素64、128 nmol／L組；24 h時(shí)，胰島素32、64、128 nmol／L組；48 h時(shí)，胰島素32、64、128 nmol／L組與正常組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，P＜0．01），表明胰島素對(duì)HMCs細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，并呈時(shí)間和濃度依賴性。見表1。

2.2As-IV對(duì)高胰島素誘導(dǎo)的HMCs增殖的影響采用單因素方差分析進(jìn)行主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)（F＝12．48，P＜0．01）。LSD兩兩比較結(jié)果顯示，與正常組比較，高胰島素組在培養(yǎng)48 h后，OD值顯著上升（P ＜0．01）。與高胰島素組比較，各用藥組OD值均下降，As-IV組隨藥物濃度的增加OD值依次降低（P＜0．05，P＜0．01），表明As-IV對(duì)高胰島素誘導(dǎo)的HMCs增殖具有抑制作用，呈濃度依賴性。見表2。

2.3As-IV對(duì)高胰島素誘導(dǎo)的HM Cs中ROS含量的影響采用單因素方差分析進(jìn)行主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)（F＝63．49，P＜0．01）。LSD兩兩比較結(jié)果顯示，與正常組比較，高胰島素組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明高胰島素加重了細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，使ROS含量升高（P＜0．01）。與高胰島素組比較，各用藥組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度均出現(xiàn)不同程度減弱，表明ROS含量降低，氧化應(yīng)激反應(yīng)減弱，且As-IV降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量呈濃度依賴性（P＜0．05，P＜0．01）。見圖1。

表1　不同濃度胰島素對(duì)體外培養(yǎng)12、24、48 h 的HMCs增殖的影響（n＝6，±s）

表1　不同濃度胰島素對(duì)體外培養(yǎng)12、24、48 h 的HMCs增殖的影響（n＝6，±s）

與12h正常組比較：＃P＜0．05，＃＃P＜0．01；與24 h正常組比較：*P＜0．05，**P＜0．01；與48 h正常組比較：△P＜0．05，△△P＜0．01

OD值組別12 h　24 h　48 h正常0．235±0．015　0．333±0．008　0．532±0．013胰島素（nmol／L）1 0．236±0．013　0．334±0．019　0．535±0．036 2 0．238±0．013　0．338±0．034　0．541±0．028 4 0．241±0．016　0．341±0．027　0．548±0．022 8 0．247±0．022　0．350±0．027　0．559±0．036 16　0．254±0．025　0．362±0．033　0．595±0．058 32　0．258±0．038　0．370±0．035*　0．615±0．068△64　0．261±0．024＃　0．384±0．050*　0．636±0．077△△128　0．271±0．026＃?！?．404±0．040**0．685±0．042△△

表2　As-IV對(duì)高胰島素誘導(dǎo)的HMCs增殖的影響（n＝6，±s）

表2　As-IV對(duì)高胰島素誘導(dǎo)的HMCs增殖的影響（n＝6，±s）

與正常組比較：＃＃P＜0．01；與高胰島素組比較：*P＜0．05，**P＜0．01

組別　48 h OD值正常0．451±0．027高胰島素（64 nmol／L）　0．579±0．013＃＃DPI（10μmol／L）　0．474±0．022**Tempol（100μmol／L）　0．452±0．032**LY294002（10μmol／L）　0．468±0．024**As-IV（μmol／L）25　0．520±0．042*50　0．494±0．030**100　0．456±0．038**

2.4As-IV對(duì)高胰島素誘導(dǎo)的HMCs中NOX4、p-Ak t、p-m TOR蛋白表達(dá)的影響采用單因素方差分析進(jìn)行主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)（F值分別為 NOX4：12．02，p-Akt：13．85，p-mTOR：47．45，P＜0．01）。LSD兩兩比較結(jié)果顯示，與正常組比較，高胰島素組HMCs中NOX4、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)均顯著增加（P＜0．01）。與高胰島素組比較，DPI組、LY294002組、As-IV 25、50、100μmol／L組HMCs中NOX4蛋白表達(dá)下調(diào)；Tempol組、LY294002組、As-IV 25、50、100μmol／L組HMCs中p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)也呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)（P＜0．05，P＜0．01）。見圖2。

3　討論

2013年調(diào)查結(jié)果顯示，根據(jù)國(guó)際最新臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)成年人DM患病率為11．6%，約1．139億人，其中，2型DM約占90%～95%。我國(guó)2型DM并發(fā)腎病的概率為34．7%。2型DM普遍存在胰島素抵抗早有定論，在此基礎(chǔ)上引發(fā)的HINS也相當(dāng)常見，而HINS在聯(lián)系DM與其他疾病中發(fā)揮著重要作用。微量白蛋白尿是早期DN的一個(gè)重要標(biāo)志，其與腎臟疾病進(jìn)程密切相關(guān)［8］。HINS與微量白蛋白尿或尿白蛋白排泄率存在明顯聯(lián)系已被大量流行病學(xué)研究［1］證實(shí)。對(duì)第三世界健康與營(yíng)養(yǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，慢性腎臟疾病的患病率與HINS呈獨(dú)立相關(guān)［2］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［3］表明，在 HINS階段即可出現(xiàn) DN的早期特征性病變即腎小球肥大。該實(shí)驗(yàn)?zāi)MHINSDM患者體內(nèi)的高胰島素環(huán)境，選取腎臟固有細(xì)胞HMCs進(jìn)行體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，不同濃度胰島素作用不同時(shí)間后，HMCs均有不同程度的增殖，呈現(xiàn)出一定的時(shí)間和濃度依賴性；其中64 nmol／L胰島素作用48 h后，HMCs增殖顯著、穩(wěn)定，同時(shí)NOX4蛋白表達(dá)上調(diào)，ROS含量增加，表明高胰島素不僅能促進(jìn)HMCs的過度增殖，還可加重其氧化應(yīng)激反應(yīng)。DPI作為特異性的NADPH氧化酶抑制劑，作用于HMCs后，NOX4蛋白表達(dá)顯著下降，ROS含量也明顯減少，表明HMCs中ROS的產(chǎn)生主要來源于NADPH氧化酶。細(xì)胞氧化應(yīng)激增強(qiáng)，不僅會(huì)對(duì)腎臟組織直接造成損傷，還可增加多種與腎臟疾病相關(guān)的信號(hào)通路的激活及細(xì)胞因子的合成分泌［9］。

PI3K／Akt／mTOR作為胰島素的主要信號(hào)通路，也是體內(nèi)重要的生存通路，在細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)錄、肥大、能量代謝、凋亡等多種細(xì)胞功能中有重要作用。Akt參與構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路，mTOR作為Akt的下游效應(yīng)物，在DN發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)節(jié)作用，不僅與2型DM發(fā)病與進(jìn)展有關(guān)，還與細(xì)胞外基質(zhì)的積累、腎臟肥大以及腎小球基底膜增厚等相關(guān)［10］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高胰島素作用48 h后，p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)增加，提示高胰島素可通過激活PI3K／Akt／mTOR信號(hào)通路加重腎損傷。

黃芪作為常用中藥，已被證實(shí)具有多種藥理作用，該實(shí)驗(yàn)主要探討As-IV防治DN作用及機(jī)制。結(jié)果顯示，各陽性藥及As-IV組均能有效抑制高胰島素誘導(dǎo)的HMCs細(xì)胞增殖，推測(cè)這可能是As-IV發(fā)揮保護(hù)作用的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。同時(shí)各用藥組亦能有效降低ROS含量，提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力。此外各用藥組還能下調(diào)p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)，抑制PI3K／Akt／mTOR信號(hào)通路的過度激活，減輕腎損傷?？寡趸瘎㏕empol在強(qiáng)效清除ROS的同時(shí)也可抑制Akt蛋白的過度磷酸化；PI3K／Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002在抑制該信號(hào)通路激活的同時(shí)也可減少ROS含量，表明ROS可參與Akt蛋白的磷酸化，而磷酸化的Akt也可增加ROS含量，ROS與Akt蛋白的磷酸化存在正相關(guān)。推測(cè)ROS與PI3K／Akt信號(hào)通路在DN的發(fā)生發(fā)展中存在協(xié)同作用，提示As-IV可以通過作用于以上兩個(gè)靶點(diǎn)，發(fā)揮其對(duì)HMCs的保護(hù)作用。

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Li Guiping，LiWeizu，Duan Wenting，et al
（Dept of Pharmacology，Anhui Medical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo investigate the protective effects of astragalosides IV（As-IV）on high insulin induced human mesangial cells（HMCs）injury in vitro and itsmechanisms．MethodsWe used HMCs as research object，treated HMCswith different concentrationsand time of insulin，analyzed the proliferation by MTT assay to select the dose-and time-dependentmanners of insulin．The HMCs was divided and treated as follows：normal group（NG），high insulin group（HINS，64 nmol／L），DPI（10μmol／L），Tempol（100μmol／L），LY294002（10μmol／L）and As-IV（25，50，100μmol／L）．After treatment for 48 hours，the proliferation of HMCswas analyzed by MTT assay．The reactive oxygen species（ROS）production wasmeasured by 2，7-dichlorodihydto fluorescin diacetate （DCFH-DA）．The expressions of NADPH oxidase 4（NOX4），phosphor-protein kinase b（p-PKB）also named p-Akt and phosphor-mammalian target of rapamycin（p-mTOR）were analyzed byWestern blot．ResultsThe proliferation of HMCswas enhanced in a dose-and time-dependentmanner by increasing concentrations and time of insulin．Compared with HINS group，DPI，Tempol，LY294002，As-IV treatment significantly inhibited HMCs proliferation，reduced intracellular ROS contents and decreased expression of NOX4，p-Akt and p-mTOR（P＜0．05，P＜0．01）．ConclusionInsulin promotes proliferation of HMCs in a time-and dose-dependent manner．As-IV has protective effects on high insulin induced HMCs injury due to inhibition of HMCs proliferation，oxidative damage，NOX4，p-Akt and p-mTOR expression．

Key wordshigh insulin；humanmesangial cells；astragalosides IV；ROS；p-Akt；p-mTOR

中圖分類號(hào)R 587．1；R 285．5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-1492（2015）11-1629-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81173624）；安徽省國(guó)際合作項(xiàng)目（編號(hào)：1230603007）；安徽省教育廳自然科學(xué)基金（編號(hào)：KJ2012A192）

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，合肥230032

作者簡(jiǎn)介：李貴平，女，碩士研究生；