顧　悅，劉莉俠，楊明珍，曾慶曙，黃震琪，吳　煒，安福潤

1，25-二羥維生素D3對免疫性血小板減少癥模型小鼠的治療作用

顧悅，劉莉俠，楊明珍，曾慶曙，黃震琪，吳煒，安福潤

摘要目的觀察并分析1，25-二羥維生素D3對免疫性血小板減少癥（ITP）模型小鼠的治療作用。方法將44只BALB／c小鼠分為正常對照組、模型組和1，25-二羥維生素D3治療組。模型組經(jīng)腹腔給予豚鼠抗小鼠血小板血清（GPAPS），治療組在模型組的基礎上經(jīng)尾靜脈注射給予100 ng／d的1，25-二羥維生素D3，正常對照組均給予相同體積的生理鹽水經(jīng)腹腔及尾靜脈注射給藥。在每次給藥后24 h記錄體重并采血，測量血小板計數(shù)，評價出血傾向。2周后處死小鼠并解剖，取骨髓涂片，鏡下計數(shù)巨核細胞。從多方面評估1，25-二羥維生素D3對模型小鼠的治療作用。結(jié)果注射第10天開始，1，25-二羥維生素D3治療組小鼠進食量開始明顯增加，精神和反應逐漸恢復；體重、血小板數(shù)較模型組明顯上升（P＜0．05）；出血傾向較模型組明顯降低（P＜0．05）；產(chǎn)板巨核細胞數(shù)較模型組高，低于正常對照組，而巨核細胞數(shù)較模型組低，高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)論1，25-二羥維生素D3對模型小鼠在一般情況的改善、體重及血小板數(shù)的上升、出血傾向的降低和促進骨髓血小板生成等方面表現(xiàn)出一定影響。

關鍵詞免疫性血小板減少癥；動物模型；1，25-二羥維生素D3

2015-07-28接收

楊明珍，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：yangmz89＠163．com．cn

1，25-二羥維生素D3［1，25-dihydroxyvitamin D3，1，25-（OH）2D3］是維生素D的生物活性形式，近年來發(fā)現(xiàn)其既可以作為先天性和獲得性免疫應答的調(diào)節(jié)劑，同時還參與多種免疫調(diào)節(jié)活動，并調(diào)控細胞增殖分化［1］。樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是一種重要的抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）。相關實驗證實，1，25-（OH）2D3不僅能抑制

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是自身免疫性疾病的一種，其發(fā)病原因之一系體內(nèi)產(chǎn)生針對自身血小板的特異性抗體，導致其破壞增多，從而導致外周血血小板減少［3-4］。該研究通過靜脈給予模型小鼠1，25-（OH）2D3，評估血小板變化并觀察其治療效果，為臨床上應用其治療ITP等自身免疫性疾病提供依據(jù)。

1　材料與方法

1．1主要試劑及儀器1，25-（OH）2D3、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑（美國Sigma公司），紅細胞裂解液（Solarbio公司）。玻璃毛細管（上海辰誼科學儀器公司），倒置顯微鏡（日本 OLYMPUS公司），血細胞計數(shù)板（上海求精生化儀器公司），多孔離心機（北京京立公司），電子分析天平（上海精密科學儀器公司）。

1．2實驗動物6～8周齡SPF級BALB／c小鼠44只，雌雄各半，18～22 g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，飼養(yǎng)和實驗均在本校SPF級動物實驗室內(nèi)進行，室溫18～22℃，濕度35%～50%，分籠飼養(yǎng)，飲水和攝食自由；5月齡清潔級豚鼠6只，480～600 g，雌雄不限，飼養(yǎng)和實驗均在清潔級動物實驗室內(nèi)進行。

1．3方法

1．3．1抗血清的制備制備抗原（即小鼠血小板）：用摘眼球取血法收集小鼠外周血至EDTA-Na2抗凝離心管，800 r／min離心6 min，將上層及兩層交界處液體小心吸出，移入另一不含抗凝劑的試管中，輕輕搖勻后即得到富含血小板的血漿（plateletrich plasma，PRP）。洗滌3次后，加生理鹽水調(diào)整血小板濃度為1×109～2×109／L。取最終得到的血小板，分別與等量完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑充分混合成油包水狀。

制備豚鼠抗小鼠血小板血清（guinea pig antimouse platelet serum，GP-APS）：取與完全弗氏佐劑混合的抗原，于第0周注射豚鼠背部、腹股溝及后足掌的皮下，每次至少4點，每點至少1 ml。取與不完全弗氏佐劑混合的抗原，分別于第1、2、4周注射于豚鼠背部、腹股溝及后足掌皮下，每次至少4點。第5周用乙醚麻醉豚鼠后，從心臟取不抗凝全血，3 000 r／min離心10 min，將上清液移入干凈的離心管，該上清液即為GP-APS，貯存于-20℃冰箱。

1．3．2實驗血清稀釋倍數(shù)的篩選取14只小鼠隨機分為7組，每組2只。將 GP-APS按1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32稀釋，分別給予第1～6組小鼠，經(jīng)腹腔注射200μl／只；第7組小鼠為正常對照組，腹腔注射等量的生理鹽水。觀察血小板下降幅度和持續(xù)下降時間，評估并選取合適的血清稀釋倍數(shù)。

1．3．3動物分組與模型建立另取30只小鼠，將其隨機分成3組：1，25-（OH）2D3治療組、模型組和正常對照組，每組10只，雌雄各半。注射APS前均記為第0天，第1次注射APS當天記為第1天。1，25-（OH）2D3治療組和模型組均分別于第1、3、5、7、11、13天依照100μl／20 g的容積質(zhì)量比給予小鼠腹腔注射1∶4稀釋的GP-APS，使小鼠的血小板慢性持續(xù)性減少；而正常對照組則在同一時間點腹腔注射等量的生理鹽水。并于注射APS第4天開始，1，25-（OH）2D3治療組每天予以尾靜脈注射100 ng 1，25-（OH）2D3，模型組在同一時間點予以尾靜脈注射等量的生理鹽水。

1．3．4血小板計數(shù)、體重和出血傾向于第2、4、6、8、10、12、14天分別從小鼠眼眶后靜脈叢取血20 μl，加入盛有980μl紅細胞裂解液的枸櫞酸納抗凝的試管內(nèi)，充分混勻后，使用血細胞計數(shù)板計量血小板數(shù)，同時用電子天平稱重小鼠，觀察并記錄體重變化及有無出血點和出血傾向（評分標準：注射處及皮下出血點＜3個＋1、＞3個＋2、口鼻出血＋1）。

1．3．5骨髓涂片巨核細胞觀察實驗結(jié)束后處死小鼠，迅速剝離胸骨，取胸骨骨髓用20μl小牛血清混勻迅速涂片并風干，瑞氏染色后在光學顯微鏡下觀察整張涂片，選擇染色良好部位，分別計數(shù)每張涂片3 cm2的巨核細胞總數(shù)以及產(chǎn)板巨核細胞數(shù)。

1．4統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16．0統(tǒng)計軟件進行分析，結(jié)果使用±s表示，計量資料選用方差分析，計算F值，組間兩兩比較選用LSD方法，計數(shù)資料使用X2檢驗，計算X2值。

2　結(jié)果

2.1GP-APS效價的評估結(jié)果顯示所有稀釋比例的APS均可以使小鼠血小板數(shù)有不同程度的降低（F＝21），降低程度與稀釋倍數(shù)呈負相關，但是1 ∶16、1∶32兩個濃度稀釋的APS組小鼠血小板數(shù)下降時間最多只能維持24 h，后迅速恢復正常。而1∶8濃度稀釋的APS亦無明顯的抑制作用，小鼠血小板下降維持36 h，后逐漸恢復正常。綜合各方面因素，可見1∶4稀釋濃度最符合本實驗需要，見圖1。

2．2小鼠體重及一般情況變化小鼠造模前稱重，3組之間體重無明顯差異（P＞0．05），見表1。注射第4天起，模型組和1，25-（OH）2D3治療組小鼠均出現(xiàn)輕微的脫毛（口鼻周圍和背部多見）、皮下瘀點（腹部及尾巴等注射部位明顯）。同時出現(xiàn)精神萎靡、反應遲鈍、進食量減少、活動量降低且有顫抖和豎毛現(xiàn)象，體重稍減輕，相關癥狀隨注射次數(shù)增加而逐漸加重。注射第10天起，1，25-（OH）2D3治療組小鼠進食量開始明顯增加，精神和反應逐漸恢復。正常對照組小鼠未出現(xiàn)類似癥狀，反應靈敏，活動進食及體重等均無明顯變化。

注射第10天，模型組小鼠體重持續(xù)降低，而1，25-（OH）2D3治療組小鼠體重呈現(xiàn)上升趨勢；注射第14天，正常對照組小鼠體重較前稍有增加，模型組小鼠體重仍較低，1，25-（OH）2D3治療組小鼠體重呈持續(xù)上升趨勢。從注射第10天起，兩組之間差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），見表1。

表1　1，25-（OH）2D3對小鼠體重的影響（g，n＝10，±s）

表1　1，25-（OH）2D3對小鼠體重的影響（g，n＝10，±s）

與正常對照組比較：*P＜0．05；與模型組比較：▲P＜0．05

組別　　第0天　　第4天　　第8天　　第10天　　第14天23．08±1．08模型　22．12±1．20　21．92±1．17　21．84±1．16*　21．73±1．15*　21．71±1．17*1，25-（OH）2D3治療　22．71±1．21　22．53±1．18　22．19±1．14*　22．51±1．12*▲　22．60±1．15正常對照　22．32±1．33　22．54±1．23　22．64±1．25　22．83±1．23*▲

2．3出血評分注射APS第4天，模型組及1，25-（OH）2D3治療組小鼠均開始出現(xiàn)不同程度的皮下出血。主要的出血部位為腹部、注射處、尾巴及生殖器等處，還有少數(shù)小鼠出現(xiàn)口鼻出血。表2顯示注射第10天，1，25-（OH）2D3治療組較模型組出血評分低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；而注射第14天，1，25-（OH）2D3治療組的出血評分仍明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。注射結(jié)束后，可見1，25-（OH）2D3治療組小鼠皮下出血部位范圍較前明顯縮小、個數(shù)減少；而模型組皮下出血部位仍較多，少數(shù)可見新發(fā)出血部位；而正常對照組小鼠無皮下出血，亦無口鼻出血。

表2　1，25-（OH）2D3對小鼠出血傾向的影響（只，n＝10）

2.41，25-（OH）2D3對小鼠血小板數(shù)的影響注射前采集小鼠外周血，3組間血小板數(shù)無明顯差異。注射第4天，模型組和1，25-（OH）2D3治療組小鼠血小板計數(shù)出現(xiàn)明顯下降；至注射第10天，模型組小鼠血小板數(shù)穩(wěn)定在較低水平，1，25-（OH）2D3治療組小鼠血小板計數(shù)有所回升；注射第14天，模型組小鼠血小板計數(shù)持續(xù)穩(wěn)定在較低水平，1，25-（OH）2D3治療組小鼠血小板較前繼續(xù)回升，正常對照組小鼠血小板維持在正常水平，稍有波動。從注射第10天起，1，25-（OH）2D3治療組較模型組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），見表3。

表3　1，25-（OH）2D3對小鼠血小板數(shù)的影響（×109／L，n＝10，±s）

表3　1，25-（OH）2D3對小鼠血小板數(shù)的影響（×109／L，n＝10，±s）

與正常對照組比較：*P＜0．05；與模型組比較：▲P＜0．05

組別　　第0天　　第2天　　第4天　　第6天　　第8天　　第10天　　第12天　　第14天187．00　1 266．50±187．74　1 167．50±178．64模型　1 323．00±110．61　934．50±47．636　662．00±74．70*　637．00±73．02*　626．00±62．84*　637．00±66．30*　630．50±67．12*　634．00±64．07*1，25-（OH）2D3治療 1 291．00±214．62　880．50±123．88　638．00±94．00*　690．00±85．95*　658．00±66．45*　690．00±74．30*▲729．00±73．23*▲785．00±84．66正常對照　1 161．50±173．40 1 279．00±158．76　1 161．50±161．13　1 277．50±171．75　1 271．50±169．31　1 177．00±*

2.51，25-（OH）2D3對小鼠巨核細胞及產(chǎn)板巨核細胞數(shù)的影響模型組小鼠的產(chǎn)板巨核細胞數(shù)較正常組明顯下降，而巨核細胞數(shù)則明顯升高，1，25-（OH）2D3治療組小鼠產(chǎn)板巨核細胞數(shù)較模型組稍高，但仍低于正常對照組，而巨核細胞數(shù)則低于模型組，高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。正常對照組小鼠的巨核和產(chǎn)板巨核細胞計數(shù)均在正常水平范圍，且形態(tài)正常，見表4。

表4　1，25-（OH）2D3對小鼠巨核細胞及產(chǎn)板巨核細胞數(shù)的影響（個／片，n＝10，±s）

表4　1，25-（OH）2D3對小鼠巨核細胞及產(chǎn)板巨核細胞數(shù)的影響（個／片，n＝10，±s）

與1，25-（OH）2D3治療組比較：*P＜0．05

組別　　骨髓產(chǎn)板巨核細胞數(shù)　　巨核細胞數(shù)正常對照　24．20±3．36*　70．10±3．38*模型　7．20±2．78*　136．50±3．81*1，25-（OH）2D3治療15．50±7．71　100．13±28．26

3　討論

ITP是一種外周血血小板數(shù)減少、血小板壽命縮短、血小板表面有抗體結(jié)合、骨髓巨核細胞代償性增多而血小板生成障礙的獲得性自身免疫性疾病，其發(fā)病機制迄今雖然尚未完全闡明，但目前多認為既有體液免疫的紊亂，也有細胞免疫的失調(diào)［5-6］，其中DC細胞為專職的抗原提呈細胞，是各種免疫應答發(fā)生的啟動、調(diào)控和維持的中心環(huán)節(jié)。既往國內(nèi)外研究［7］表明，ITP患者外周DC細胞功能出現(xiàn)異常：一方面，DC細胞表面分子的過多表達或受體的表達缺陷，都可促使T細胞亞群功能失常和比例失調(diào)，而引起強烈的自身免疫反應；另一方面，DC細胞可以通過分泌B細胞活化因子（BAFF）、TNF家族因子增殖誘導配體（APRIL）等促進B細胞生存和分化成熟，從而直接促進B細胞分泌自身抗體。這些均表明DC細胞在ITP等自身免疫疾病的發(fā)病機制中有重要的作用。

前期實驗結(jié)果證實，在體外使用生理劑量1，25-（OH）2D3處理體外擴增小鼠骨髓來源DC后，可以得到共刺激分子表達水平明顯降低、激活T細胞能力減弱的耐受性未成熟DC，從而可以誘導免疫耐受［2］。

本研究通過給予小鼠GP-APS模擬ITP發(fā)病機制中的抗體破壞血小板這一過程，建立被動性小鼠ITP模型。在注射第3天即可見模型組和1，25-（OH）2D3治療組血小板明顯下降，并可見皮下出血，甚至口鼻出血，之后血小板一直穩(wěn)定在較低水平；而注射第14天后處死小鼠，取骨髓涂片計數(shù)巨核細胞數(shù)示代償性增多，其中產(chǎn)板巨核細胞數(shù)則明顯降低，均符合ITP表現(xiàn)，表明該模型建立成功。在此模型基礎上，從注射血清第4天開始給予1，25-（OH）2D3治療，發(fā)現(xiàn)注射第8天，治療組小鼠血小板在降至最低后開始上升，但差異無統(tǒng)計學意義。上升趨勢從注射第10天開始明顯，并一直呈持續(xù)上升狀態(tài)，同時伴有出血評分下降。這些結(jié)果都證明了1，25-（OH）2D3針對ITP等自身免疫疾病具有一定的治療作用，雖然治療效果在第10天才具有明顯差異性，表明其發(fā)揮作用需要一定時間。

近幾年來，已有較多相關實驗證實，1，25-（OH）2D3作為免疫調(diào)節(jié)劑可以改變不同免疫細胞的作用，調(diào)整單核細胞的細胞因子外形結(jié)構(gòu)，促使原始T淋巴細胞向調(diào)節(jié)T細胞轉(zhuǎn)化，還可以干擾DC細胞的分化和成熟［8-10］，將其鎖定在半成熟的狀態(tài)［11］，這種轉(zhuǎn)變后的DC細胞共刺激分子表達水平降低。它還可以抑制白介素-12的分泌［12-13］，從而可以改變T淋巴細胞的免疫功能，誘導T細胞的無反應性，提高凋亡水平［10，14］。同時將T細胞的細胞因子應答反應，從與Th 1和Th 17共同作用的促炎反應，轉(zhuǎn)換為與Th 2和調(diào)節(jié)性T細胞共同作用的更有耐受性的反應，從而誘導免疫耐受性［15-17］。筆者考慮1，25-（OH）2D3可能通過以上各種免疫調(diào)節(jié)作用誘導DC細胞的耐受性，從而發(fā)揮對ITP的治療作用。下一步實驗即可收集模型組及1，25-（OH）2D3治療組小鼠的骨髓來源DC細胞，體外培養(yǎng)后，通過流式細胞術等技術測量DC細胞表面共刺激分子等表達水平，驗證是否具有免疫耐受性。

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AbstractObjectiveTo observe and analyze the therapeutic effect of 1，25-dihydroxyvitamin D3on the immune thrombocytopenia（ITP）model inmice．Methods44 BALB／cmicewere divided into three groups：normal control group，model group and 1，25-dihydroxyvitamin D3treatmentgroup．Themodelgroup was given the GP-APS intraperitoneally，while the treatment group，on the basis of themodel group，was administered 100 ng／d of 1，25-dihydroxyvitamin D3by intravenous injection，and the normal control group was given the same volume of saline through both intraperitoneal and intravenous injection．The mice were taken blood samples after 24 hours of each administration，recorded their weights andmeasured platelet accounts and bleeding tendencies．After two weeks of injection，themice were sacrificed and dissected，smeared with the bonemarrow thathad been taken out，counted the number ofmegakaryocyte under themicroscope．Assessed the therapeutic effectof1，25-dihydroxyvitamin D3on themodelmice in several aspects．ResultsFrom the 10th day of the injection，the food-intake of the treatment group wasmarkedly increased，the spirit status and reaction was gradually recovered；the body weight and platelet account，compared with themodel group，were both significantly increased（P＜0．05）；bleeding tendency evident wasmarkedly decreased（P＜0．05）；the number of the platelet-formingmegakaryocyte was higher than themodel group and lower than the normal control group，while the number of the megakaryocyte was lower than the model group and higher than the normal control group，the difference was statistically significant．Conclusion1，25-dihydroxyvitamin D3shows some influence on the improvementof general status，the rise of body weight and platelet account，the reduction of bleeding tendency and the promotion of platelet＇s production of themodelmice．

Key wordsimmune thrombocytopenia；animalmodel；1，25-dihydroxyvitamin D3

Effect and mechanism ofm iRNA-4465 overexpression in them igration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells

Luo Guangtao，Wang Benzhong
（Dept of Breast Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022）

AbstractObjectiveTo investigate the effect of overexpression of miRNA-4465 on invasion and metastasis of breast cancer MDA-MB-231 cells and its mechanism．MethodsMiRNA-4465 minics was transfected into the MDA-MB-231 cells，and real-time PCR was used to detect the expression ofmiRNA-4465．Transwell assay was used to investigate themigration and invasion capability of cells after being transfected．Bioinformatics analysiswere performed to predict the potential targets ofmiRNA-4465，and finally，luciferase reporter plasmids assay and western blotwas used to confirm the potential target ofmiRNA-4465．Resu ltsComparing with negative control group，the expression ofmiRNA-4465 inmiRNA-4465minics group was increased significantly．Transwellmigration assay showed thatmigration capability of cells in miRNA-4465 minics group was decreased（P＝0．001）；transwell invasion assay showed that invasion capability of cells inmiRNA-4465 minics group was decreased（P＝0．010）．Luciferase reporter plasmids assay showed that comparing with the negative control＋psiCHECK2-EZH2 3’UTR（wild type），the fluorescence activity ofmiRNA-4465 minics＋psiCHECK2-EZH2 3’UTR（wild type）was decreased by 66%（P＝0．001）．Moreover，comparing with the negative control group，the expression of EZH2 protein was decreased after transfecting miRNA-4465 minics into MDA-MB-231 cells．ConclusionMiRNA-4465 can suppress the invasion and metastasis of breast cancer MDA-MB-231 cells，whichmay be related to the regulation of EZH2．

Key wordsmiRNA-4465；EZH2；breast cancer；metastasis人外周血來源DC的成熟和分化，對小鼠骨髓來源DC也有著類似作用［2］。

The therapeutic effect of 1，25-dihydroxyvitam in D3on ITP m icemodel

Gu Yue，Liu Lixia，Yang Mingzhen，et al
（Dept of Hematology，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230022）

中圖分類號R 558＋．2

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1574-05

基金項目：安徽省自然科學基金（編號：1208085MH154）

作者單位：安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液科，合肥230022

作者簡介：顧悅，女，碩士研究生；