程曦 王文義 邱金龍

（中國科學(xué)院微生物研究所植物基因組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101）

基因組編輯：植物生物技術(shù)的機(jī)遇與挑戰(zhàn)

程曦 王文義 邱金龍

（中國科學(xué)院微生物研究所植物基因組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101）

基于序列特異性核酸酶的基因組編輯技術(shù)可以在不同物種中對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除，并可實(shí)現(xiàn)特定基因片段置換，基因的定點(diǎn)插入等基因組靶向修飾?；蚪M編輯是一種精準(zhǔn)和高效的基因工程方法，近年來快速發(fā)展并得到了廣泛的應(yīng)用，并將改變生物技術(shù)的現(xiàn)狀。目前，基因組編輯在不同植物，特別是農(nóng)作物中的技術(shù)體系已建立，初步展示了其在植物生物技術(shù)領(lǐng)域的巨大潛力。介紹了不同基因組編輯系統(tǒng)的工作原理，并對(duì)基因組編輯技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用及成功案例進(jìn)行了綜述，最后對(duì)基因組編輯在植物生物技術(shù)領(lǐng)域所面臨的機(jī)遇與挑戰(zhàn)進(jìn)行了討論。

序列特異性核酸酶；基因組編輯；植物基因工程

隨著新一代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，越來越多的植物物種完成了全基因組測(cè)序工作。面對(duì)海量的基因組序列信息，科研工作者面臨的新挑戰(zhàn)就是如何解讀這些序列信息和詮釋基因的功能，并利用基因組信息為人類造福。過去幾十年中，通過轉(zhuǎn)座子或T-DNA插入和RNA干擾下調(diào)特定基因表達(dá)的“反向遺傳學(xué)”成為分析基因功能的一種有效方法。但T-DNA或轉(zhuǎn)座子插入是隨機(jī)的，在基因組上的位置是不可控的；同時(shí)，RNA干擾效果是短暫的，對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控不可穩(wěn)定遺傳。Cre/loxP系統(tǒng)［1］、PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)［2］、PhiC31整合酶系統(tǒng)［3，4］等位點(diǎn)特異性重組技術(shù)在體外實(shí)驗(yàn)或模式動(dòng)物中可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的定點(diǎn)修飾，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用，但不能廣泛適用于植物基因功能的研究。此外，因?yàn)樵谥参镏型粗亟M的效率很低，所以對(duì)植物基因組進(jìn)行精確修飾和改造非常困難。近幾年，基于序列特異性核酸酶的基因組編輯技術(shù)的出現(xiàn)，為植物基因組定點(diǎn)修飾提供了行之有效的新方法，成為研究植物基因功能的重要工具。

基因組編輯是使用序列特異性核酸酶在基因組特定位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)DNA的插入、替換或刪除，從而在基因組水平對(duì)基因進(jìn)行精確、定向修飾的一種高效的基因工程方法。序列特異性核酸酶錨定到基因組上的靶位點(diǎn)，對(duì)靶標(biāo)DNA進(jìn)行切割產(chǎn)生雙鏈斷裂（Double strand breaks，DSBs）。細(xì)胞通過同源重組（Homologous recombination，HR）或非同源末端連接（Non-homologous ending-joining，NHEJ）兩種不同修復(fù)機(jī)制對(duì)DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂進(jìn)行修復(fù)［5］。絕大多數(shù)情況下，DNA雙鏈斷裂通過非同源末端連接修復(fù)。而非同源末端連接是易錯(cuò)的，常常造成堿基的添加或缺失，兩者都可造成突變，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的定點(diǎn)修飾。如有DNA供體，通過同源重組修復(fù)雙鏈斷裂，有可能會(huì)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行定點(diǎn)突變或者基因置換。

目前，用于基因組編輯的序列特異性核酸酶主要有鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs），類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白核酸酶（Transcription activatorlike effector nuclease，TALEN），以及CRISPR/Cas9系 統(tǒng)（CRISPR/Cas9system）。 尤 其 是TALEN及CRISPR/Cas9系統(tǒng)相對(duì)簡單，目前已經(jīng)得到了相對(duì)廣泛的應(yīng)用。本文將首先綜述不同基因組編輯系統(tǒng)的工作原理；然后重點(diǎn)介紹基因組編輯技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用；最后討論并展望基因組編輯為植物生物技術(shù)研究和應(yīng)用所帶來的機(jī)遇與挑戰(zhàn)。

1 基因組編輯技術(shù)的工作原理

1.1 鋅指核酸酶技術(shù)

鋅指核酸酶由鋅指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）和核酸內(nèi)切酶FokⅠ的核酸酶活性域兩部分融合而成［6］。其中，ZFP是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)特定核苷酸序列的識(shí)別與結(jié)合，通常由3-4個(gè)Cys2-His2鋅指蛋白串聯(lián)而成，每個(gè)鋅指蛋白識(shí)別并結(jié)合一個(gè)特異的堿基三聯(lián)體，因此每個(gè)ZFP結(jié)合域能識(shí)別一段9-12 bp的堿基序列。Fok I是一種非特異性的核酸內(nèi)切酶，對(duì)切割位點(diǎn)不具識(shí)別特異性，并且僅在二聚體狀態(tài)下才具備核酸酶活性。所以，針對(duì)每一個(gè)靶位點(diǎn)需要設(shè)計(jì)一對(duì)ZFNs，這對(duì)ZFNs的結(jié)合序列的間隔區(qū)域通常保持在5-7 bp以確保Fok I二聚體的形成［7，8］，這樣一對(duì)ZFNs可對(duì)靶序列進(jìn)行特異切割并產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂。

1.2 TALEN 技術(shù)

TALEN的構(gòu)成與ZFN相似，由TALE（Transcription activator-like effector）蛋白DNA結(jié)合域和FokⅠ核酸酶兩部分融合而成。TALE蛋白DNA結(jié)合域負(fù)責(zé)靶序列的特異性識(shí)別，而FokⅠ負(fù)責(zé)靶位點(diǎn)的切割。TALE是黃單胞屬（Xanthomonas）植物病原菌分泌的一類效應(yīng)蛋白，其DNA結(jié)合域由13-28個(gè)串聯(lián)的具有DNA識(shí)別特異性的高度保守的重復(fù)單元組成。每個(gè)重復(fù)單元含有大約34個(gè)氨基酸［9，10］，且不同單元的氨基酸序列非常保守，僅第12和13位氨基酸不同。這兩個(gè)可變氨基酸被稱為重復(fù)可變的雙氨基酸殘基（Repeat-variable diresidue，RVD），它們決定重復(fù)單元的DNA識(shí)別特異性。例如，NI識(shí)別A、HD識(shí)別C、NG識(shí)別T、NN和NK識(shí)別G［11，12］。構(gòu)建識(shí)別特定靶序列的TALEN時(shí)，只需把與序列對(duì)應(yīng)的重復(fù)單元進(jìn)行串聯(lián)組裝即可。同樣，由于Fok I在二聚體狀態(tài)下才具有核酸酶活性，針對(duì)每一個(gè)靶位點(diǎn)也需要上下游各設(shè)計(jì)一個(gè)TALEN，這對(duì)TALENs結(jié)合序列的間隔區(qū)則在12-21 bp之間。

1.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)

在超過40%的真細(xì)菌和90%的古細(xì)菌中存在一類特殊的成簇DNA序列，它們由一系列短的高度保守的正向重復(fù)序列（Direct repeat，DR）與高度可變的間隔序列（spacer）交替排列組成，被稱為成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat，CRISPR）［13，14］。在CRISPR側(cè)翼區(qū)域存在CRISPR相關(guān)基因（CRISPR-associated，Cas）。CRISPR/Cas是古細(xì)菌和真細(xì)菌用于清除外源入侵DNA 的一種免疫系統(tǒng)［15］。根據(jù)Cas基因核心元件序列的不同，CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)被分為3種類型，其中Ⅱ型系統(tǒng)最簡單。人們改造了II 型CRISPR/Cas系統(tǒng)成為序列特異性核酸酶，使其能夠像ZFN 和TALEN 那樣對(duì)DNA進(jìn)行靶向切割，稱為CRISPR/Cas9系統(tǒng)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)只由Cas9 蛋白與sgRNA（single-guide RNA）構(gòu)成，通過sgRNA與靶序列DNA的堿基配對(duì)招募Cas9蛋白來切割DNA雙鏈，產(chǎn)生DNA 雙鏈斷裂［16］。靶序列通常由23個(gè)堿基組成，包括與sgRNA堿基配對(duì)的前20個(gè)堿基以及3'端Cas9識(shí)別的三核苷酸NGG的PAM（protospacer adjacent motif）序列。Cas9切割位點(diǎn)位于PAM上游3 nt處。靶序列的結(jié)合特異性是由sgRNA和PAM序列共同決定的。Cas9 蛋白不需要形成蛋白二聚體起作用，而gRNA（guide RNA）通過堿基互補(bǔ)配對(duì)決定靶序列的特異性，因此，CRISPR/Cas9系統(tǒng)大大降低了技術(shù)門檻，一經(jīng)面世就迅速得到廣泛應(yīng)用。

2 基因組編輯技術(shù)在植物中的應(yīng)用

2.1 基因敲除

基因敲除是研究基因功能最直接而有效的手段。以基因組靶向修飾為基礎(chǔ)的反向遺傳學(xué)研究，成為基因組編輯在植物生物學(xué)中最直接的應(yīng)用（圖1-A，B）。不同的基因組編輯系統(tǒng)均可在特定位點(diǎn)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，通過發(fā)生頻率高的NHEJ修復(fù)機(jī)制，可以在切口處引起堿基的插入或缺失，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯的提前終止或移碼突變，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)靶基因的定點(diǎn)敲除。目前，利用不同的基因組編輯系統(tǒng)，已經(jīng)在擬南芥、煙草、水稻、番茄、馬鈴薯、玉米和小麥等多種植物中實(shí)現(xiàn)了靶基因敲除。

2005年，Lloyd等［17］首先利用ZFN在擬南芥中對(duì)人工設(shè)計(jì)的靶序列進(jìn)行了定點(diǎn)修飾；在ZFN誘導(dǎo)的106個(gè)突變中，有78%是序列缺失，13%是序列插入，8%是插入和缺失同時(shí)發(fā)生；有10%突變可以遺傳到下一代。2010年，Zhang等［18］用ZFNs對(duì)擬南芥的ADH1（ALCOHOL DEHYDROGENASE1）及TT4（TRANSPARENT TESTA4）基因?qū)崿F(xiàn)了定點(diǎn)突變。在T1代轉(zhuǎn)基因植物中，ADH1和TT4 基因的突變率分別為7%和16%，突變類型包括堿基的插入或缺失；產(chǎn)生的突變分別以69%及33%的頻率穩(wěn)定遺傳給下一代，最終通過遺傳篩選及鑒定獲得具有丙烯醇抗性的adh1突變體及種皮發(fā)黃的tt4突變體，純合突變植物比例約為20%。同時(shí)，ZFNs被用于對(duì)擬南芥的ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因ABSISCIC ACIDINSENSITIVE 4（ABI 4）的定向敲除并成功得到對(duì)ABA不敏感的abi4突變體［19］。大豆是古四倍體植物，其染色體中有大約75%的基因是重復(fù)的，遺傳操作非常困難。但研究發(fā)現(xiàn)，ZFNs也可以對(duì)大豆基因組中序列高度相似的重疊基因（duplicated genes）進(jìn)行敲除［20］。此外，ZFNs也被成功用于敲除玉米內(nèi)源基因［21］。雖然ZFN在不同植物中獲得了成功應(yīng)用，但由于鋅指單元對(duì)DNA識(shí)別特異性并不嚴(yán)謹(jǐn)，在不同的鋅指串聯(lián)中識(shí)別的序列差異較大，因此，ZFN常常表現(xiàn)高頻率的脫靶效應(yīng)（off-target effect）。此外，有效ZFN的構(gòu)建也相當(dāng)困難。這些都妨礙了該技術(shù)的進(jìn)一步廣泛應(yīng)用，目前基本上已被新發(fā)展起來的TALEN和CRISPR/Cas9系統(tǒng)所取代。

TALEN技術(shù)面世后，迅速在擬南芥原生質(zhì)體中實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源靶基因敲除，證明了其在植物細(xì)胞中的適用性［22］。隨之，Li等［23］用TALENs定向破壞了水稻感病基因OsSWEET14啟動(dòng)子中的效應(yīng)蛋白結(jié)合元件（effector-binding element，EBE），有效阻止了水稻白葉枯菌（Xanthomonasoryzae）分泌的效應(yīng)蛋白與OsSWEET14基因啟動(dòng)子的結(jié)合，使OsSWEET14基因的表達(dá)不受白葉枯菌控制，從而提高了水稻對(duì)白葉枯病的抗性，同時(shí)也不影響水稻生長發(fā)育中的功能。Shan等［24］構(gòu)建了一系列TALENs，高效敲除了水稻中的OsDEP1、OsBADH1、OsCKX2、OsSD1基因與二穗短柄草中的BdABA、BdCKX2、BdSMC6、BdSPL、BdSPB、BdCOI1、BdRHT、BdHTA1基 因。在大豆中，利用TALENs對(duì)脂肪酸脫氫酶（Fatty acid desaturase）基因FAD2-1A和FAD2-1B進(jìn)行了靶向修飾［25］。通過鑒定，在19個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中有4個(gè)株系的FAD2-1A和FAD2-1B基因位點(diǎn)產(chǎn)生了突變，且3/4的突變可以穩(wěn)定遺傳到下一代。在這兩個(gè)基因的雙純合突變中油酸含量從20%提高到80%，而對(duì)人體健康有害的亞油酸含量則從50%降低到4%，提高了大豆的產(chǎn)油量及品質(zhì)。在玉米中，利用TALENs也成功對(duì)玉米的ZmPDS、ZmIPK1A、ZmIPK、ZmMRP4基因進(jìn)行了敲除，在轉(zhuǎn)基因玉米中TALENs誘導(dǎo)的突變效率在13.3%-39.1%之間［26］。

序列特異性核酸酶，包括TALEN，在多倍體植物中的應(yīng)用一直未建立。普通小麥?zhǔn)钱愒戳扼w，基因組龐大且重復(fù)序列高。因此，針對(duì)小麥的基因功能研究及遺傳育種都非常困難。最新的研究表明，TALEN能有效地對(duì)普通小麥基因組進(jìn)行靶向的基因組編輯。MLO基因在大麥、擬南芥等多種植物中被證明是白粉病菌成功侵染所必需的，一旦突變，植物就表現(xiàn)出對(duì)白粉病菌的持久、廣譜抗性。Wang等［27］利用TALENs獲得了對(duì)小麥MLO基因在A、B和D基因組上的3個(gè)拷貝的定點(diǎn)突變，產(chǎn)生的突變可以穩(wěn)定遺傳到后代并符合孟德爾遺傳規(guī)律。通過小麥白粉菌侵染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)只有普通小麥A、B和D基因組上3個(gè)MLO基因拷貝同時(shí)突變的純合突變體tamlo-aabbdd表現(xiàn)出對(duì)白粉菌極為顯著的抗性，表明小麥MLO基因的3個(gè)拷貝在功能上存在冗余，這也可能是到目前為止在自然條件下或利用傳統(tǒng)育種手段而沒有獲得小麥mlo抗病材料的主要原因。此外，該研究還利用基因組編輯技術(shù)在小麥中實(shí)現(xiàn)了基因的定點(diǎn)插入，插入的片段可以穩(wěn)定遺傳，這可用于創(chuàng)制不能由簡單基因敲除而產(chǎn)生的優(yōu)良遺傳特性。該研究首次在一個(gè)多倍體物種中證明可以對(duì)多個(gè)部分同源的基因同時(shí)并準(zhǔn)確地進(jìn)行編輯，展示了通過基因組編輯可以實(shí)現(xiàn)不同物種的育種信息資源共享。

2013年是CRISPR/Cas技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用的高峰，在植物中也得到了快速而廣泛的應(yīng)用。2013年8月，Nature Biotechnology雜志同時(shí)報(bào)道了3 個(gè)實(shí)驗(yàn)室利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)分別在雙子葉植物擬南芥、煙草及單子葉植物水稻、小麥中成功實(shí)現(xiàn)基因組定點(diǎn)編輯的操作。其中，在擬南芥和煙草原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)CRISPR/Cas9，產(chǎn)生的突變效率分別可達(dá)到5.6%和38.5%［28］；而利用農(nóng)桿菌注射方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草時(shí)，突變效率為1.8%-2.4%［29］。Shan等［30］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點(diǎn)敲除水稻PDS基因，在水稻原生質(zhì)體中基因突變效率為14.5%-38.0%，轉(zhuǎn)基因水稻中基因突變效率為4.0%-9.4%，T0代得到的pds純合突變體表現(xiàn)出典型的白化和矮小表型。此后，CRISPR/Cas9系統(tǒng)被應(yīng)用于多個(gè)植物物種中，包括擬南芥、煙草、水稻、小麥、高粱、玉米、番茄等［28-35］。例如，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻中誘導(dǎo)產(chǎn)生葉綠素含量降低的cao1突變體和分蘗夾角增大的lazy1突變體［31］。Brooks等［32］用CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向修飾番茄ARGONAUTE7基因，在T0代中就得到了有針狀葉片表型的突變植株。有趣的是，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在陸生植物進(jìn)化研究的模式植物地錢的配子體中也得到成功應(yīng)用，通過對(duì)AUXIN RESPONSEFACTOR 1（ARF1）定向敲除，得到生長素不敏感突變體，而且產(chǎn)生的突變可穩(wěn)定遺傳到無性世代［33］。

2.2 多基因敲除及染色體重排

利用基因組編輯技術(shù)也可以對(duì)多個(gè)基因，甚至非同源的基因同時(shí)敲除，為研究植物復(fù)雜性狀及功能途徑提供了重要手段。通常是將靶向不同基因的ZFNs、TALENs或sgRNA同時(shí)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，因?yàn)橥蛔冃什皇?00%，所以需要后期篩選以得到多個(gè)基因同時(shí)突變的植株。例如，將分別靶向OsDEP1、OsCKX2和OsBADH2基因的3對(duì)TALENs同時(shí)轉(zhuǎn)化水稻，在T0代得到了單基因、雙基因及三基因發(fā)生突變的植株，其中三基因同時(shí)產(chǎn)生突變的效率為1.9%［36］。此外，科學(xué)家們也發(fā)展了一些用于多基因敲除的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。其中，第一代是將多個(gè)gRNA串聯(lián)在同一個(gè)質(zhì)粒上，并由RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄［37］。這樣隨著靶向的基因數(shù)量的增加，質(zhì)粒變得越來越大，同時(shí)，RNA聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄需要從特定的核苷酸起始，這些都限制該體系的應(yīng)用。最近，一個(gè)全新的通過把tRNA-gRNA串聯(lián)排列高效表達(dá)多個(gè)gRNA的方法被建立，克服了以上問題，大大提高了對(duì)植物多個(gè)基因的敲除效率［38］。

同時(shí)對(duì)兩個(gè)基因組位點(diǎn)進(jìn)行靶向切割，在染色體上產(chǎn)生兩個(gè)切口。當(dāng)兩個(gè)切口在同一條染色體上時(shí)，修復(fù)時(shí)將有可能刪除切口間的片段；也可能該片段反轉(zhuǎn)后再修復(fù)，則產(chǎn)生該片段染色體的倒位。當(dāng)兩個(gè)切口不在同一染色體上，則有可能產(chǎn)生染色體的易位。例如，用ZFNs對(duì)擬南芥兩條染色體上3個(gè)基因簇分別進(jìn)行了片段刪除，刪除長度可高達(dá)55 kb，效率在1%左右；實(shí)驗(yàn)中也觀察到了染色體片段倒位及重復(fù)的發(fā)生［39］。染色體重排（chromosomal rearrangement）為研究復(fù)雜基因的功能、長鏈非編碼RNA、基因調(diào)控序列及基因簇的功能等提供了重要手段，也為在染色體水平上改造植物提供了可能。

2.3 點(diǎn)突變，基因置換及基因定點(diǎn)插入

雖然基因敲除是研究基因功能的重要手段，但有些基因的敲除是致死的。同時(shí)，一些重要的植物性狀是由基因點(diǎn)突變引起的。所以，利用基因組編輯進(jìn)行點(diǎn)突變和基因置換（gene replacement）成為科學(xué)家追求的目標(biāo)?；蚪M編輯進(jìn)行點(diǎn)突變和基因置換通常是利用細(xì)胞修復(fù)雙鏈斷裂的同源重組（HR）機(jī)制來完成，除序列特異性核酸酶外，還需要加入與切口兩側(cè)序列同源的供體DNA分子作為模板，使得供體DNA與雙鏈斷裂處的序列發(fā)生同源重組，從而特異地改變一個(gè)基因的序列或置換掉內(nèi)源序列［40］。植物中，利用基因組編輯技術(shù)進(jìn)行點(diǎn)突變和基因置換只是原生質(zhì)體中獲得了成功［30，41，42］，在植株水平上還未見報(bào)道，這可能由于NHEJ是DNA斷裂的主導(dǎo)修復(fù)途徑，而HR只發(fā)生在特定的細(xì)胞周期和類型中。因此，科學(xué)家們嘗試能否利用NHEJ修復(fù)方式實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的點(diǎn)突變和置換。Weinthal等［43］在擬南芥和煙草中通過NHEJ修復(fù)方式實(shí)現(xiàn)了基因替換。但因?yàn)镹HEJ修復(fù)是易錯(cuò)的，做到精確的基因替換還需要后續(xù)的研究來不斷完善。相對(duì)而言，基因的定點(diǎn)插入效率比較高，已在多種植物中實(shí)現(xiàn)，并且這種定點(diǎn)插入可穩(wěn)定遺傳到下一代［21，27，44，45］。如在玉米中，利用ZFN把抗除草劑基因PAT定點(diǎn)插入到編碼肌醇-1，3，4，5，6-戊基磷酸酶的IPK1基因中，最終得到抗除草劑且植酸含量降低的玉米，定點(diǎn)插入的效率高達(dá)10%［21］。Wang等［27］用TALEN在小麥原生質(zhì)體中通過NHEJ修復(fù)途徑將報(bào)告基因GFP插入TaMLO基因位點(diǎn)，插入效率達(dá)6.5%；同時(shí)在小麥轉(zhuǎn)基因植株中也分別以1.4%和2.6%的效率將His-tag和Myc-tag整合在TaMLO位點(diǎn)，插入片段可穩(wěn)定遺傳到下一代。

2.4 基因組編輯系統(tǒng)的改造及新應(yīng)用

隨著基因組編輯技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，基于序列特異性核酸酶（Sequence-specific nucleases，SSNs），特別是Cas9的一些新的衍生技術(shù)被開發(fā)（圖1）。這些衍生技術(shù)主要是將不同蛋白功能與SSN的DNA結(jié)合特異性相融合，從而達(dá)到對(duì)特定DNA序列的修飾、分離和觀察的目的。例如，將不具有核酸剪切活性的 dCas9（dead Cas9）與負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄抑制、表觀調(diào)控和熒光表達(dá)等蛋白相融合，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄水平及表觀遺傳的調(diào)控，或?qū)蚪M特定位座（loci）進(jìn)行熒光成像和實(shí)時(shí)觀察。這些基因組編輯衍生技術(shù)為植物研究及生物技術(shù)提供了更多的技術(shù)手段。其中，基于序列特異性核酸酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及表觀修飾（圖1-C，D，E）已有報(bào)道［46，47，48］。雖然目前靶基因組位座動(dòng)態(tài)熒光觀察（圖1-F）、靶位點(diǎn)染色質(zhì)的純化（圖1-G）還未在植物中實(shí)現(xiàn)，但為基因組編輯在植物生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的方向。在動(dòng)物細(xì)胞系中利用CRISPR進(jìn)行全基因組水平的基因功能篩選已經(jīng)成熟。而植物中，由于缺乏合適的培養(yǎng)細(xì)胞功能檢測(cè)體系和高通量的轉(zhuǎn)化體系及表型鑒定系統(tǒng)，利用sgRNA文庫對(duì)植物進(jìn)行全基因組功能篩選（圖1-H）也尚待建立。

3 基因組編輯給植物生物技術(shù)帶來的機(jī)遇與挑戰(zhàn)

隨著1983年世界首例轉(zhuǎn)基因植物——煙草的問世，以轉(zhuǎn)基因?yàn)楹诵牡闹参锷锛夹g(shù)對(duì)植物功能基因組研究及農(nóng)作物品種改良等方面做出了重大貢獻(xiàn)。轉(zhuǎn)基因操作通常在植物中引入外源性基因，且轉(zhuǎn)基因在植物基因組中插入是隨機(jī)的，雖然至今為止，沒有證據(jù)證明轉(zhuǎn)基因植物是有生物安全性問題，但還是引起公眾普遍的關(guān)注。美國和歐盟對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的上市也有非常嚴(yán)格的要求。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在歐盟一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物從研發(fā)到商業(yè)化上市大約需要花費(fèi)1 000萬歐元。因此，目前只有大的跨國企業(yè)有能力進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的商業(yè)化研發(fā)［49］。如前所述，基因組編輯獲得的植物材料與自然突變或物理、化學(xué)誘變的機(jī)理一樣，在基因組中也只有部分堿基的添加、缺失或替換，因此，分子檢測(cè)無法分辨基因組編輯獲得的植物突變體與常規(guī)突變體。另一方面，因?yàn)榛蚪M編輯是對(duì)目標(biāo)基因的定向修飾，這樣就不需要常規(guī)育種所必需的大規(guī)模的分離后代的基因型和表型篩選，大大節(jié)約了時(shí)間和成本。所以，基因組編輯技術(shù)的出現(xiàn)為植物生物技術(shù)及作物分子育種提供了前所未有的機(jī)遇。同時(shí)，基因組編輯與其它先進(jìn)生物技術(shù)結(jié)合也可以產(chǎn)生很多意想不到的巨大突破。基因組編輯迅猛發(fā)展的勢(shì)頭及其迅速廣泛的應(yīng)用也預(yù)示著它將如分子克隆、PCR一樣在不遠(yuǎn)的未來改變植物學(xué)研究和植物生物技術(shù)的現(xiàn)狀。我國應(yīng)繼續(xù)保持在該領(lǐng)域的領(lǐng)先地位，促進(jìn)我國生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

任何新技術(shù)的出現(xiàn)都是機(jī)遇與挑戰(zhàn)并存，基因組編輯的應(yīng)用也面臨著技術(shù)優(yōu)化和政策法規(guī)兩個(gè)層面的挑戰(zhàn)。如何提高植物基因組定向修飾的效率及避免脫靶效應(yīng)成為基因組編輯在產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用中亟需解決的關(guān)鍵問題。表達(dá)系統(tǒng)與轉(zhuǎn)化方式直接影響對(duì)不同植物的定點(diǎn)修飾效率［50］；基因組編輯元件在細(xì)胞中的表達(dá)水平、目標(biāo)序列在基因組中的位置和細(xì)胞生長的生理階段都對(duì)基因定點(diǎn)修飾效率有很重要的影響；研究者需要根據(jù)不同的要求找到最適合于目標(biāo)植物定點(diǎn)修飾的表達(dá)系統(tǒng)及轉(zhuǎn)化手段?；蚪M編輯在植物中可能產(chǎn)生一定的脫靶效應(yīng)，脫靶突變的產(chǎn)生可能對(duì)基因組編輯在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用產(chǎn)生嚴(yán)重影響［51］。目前，可以通過靶位點(diǎn)選擇、優(yōu)化FokI切割結(jié)構(gòu)域、改造sgRNA和優(yōu)化核酸酶的表達(dá)水平等方式來減少脫靶效應(yīng)［52-55］，但在植物中還需要更加深入系統(tǒng)的研究來解決這些問題。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)不同應(yīng)用示例

國際上對(duì)基因組編輯產(chǎn)生的植物新品種的監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)存在爭議：美國的農(nóng)業(yè)監(jiān)管部門認(rèn)為由細(xì)胞自我修復(fù)機(jī)制產(chǎn)生的突變植物不屬于轉(zhuǎn)基因［56］，因此，如果不是通過植物病原，如農(nóng)桿菌等介導(dǎo)的基因組編輯植物不被定義為轉(zhuǎn)基因生物（genetically modified organism，GMO）。目前，至少兩種基因組編輯的植物產(chǎn)品獲得了美國農(nóng)業(yè)部的批準(zhǔn)，一個(gè)是植酸含量低的玉米品種，另一個(gè)是抗除草劑的油菜品種。加拿大也批準(zhǔn)了基因組編輯的抗除草劑油菜的商業(yè)化［57］。與此相反，歐盟委員會(huì)規(guī)定非自然方式產(chǎn)生的基因修飾就是GMO，但是他們同時(shí)認(rèn)為物理和化學(xué)誘變獲得植物突變體不在這個(gè)范圍內(nèi)。然而基因組編輯植物與物理和化學(xué)誘變獲得植物無法區(qū)分，因此，歐盟委員會(huì)面臨一個(gè)兩難的境地，對(duì)基因組編輯植物的監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)存在不確定性［49］。但最近，歐盟委員會(huì)也傾向基因組編輯植物不被定義為GMO。而在我國，目前還沒有監(jiān)管基因組編輯植物的相關(guān)政策法規(guī)出臺(tái)。放眼未來，基因組編輯技術(shù)能使我們對(duì)植物基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)、高效的改造，其在作物改良育種中的優(yōu)勢(shì)是無可比擬的。因此，國家需要制定出合理的監(jiān)管制度來積極規(guī)范和推動(dòng)基因組編輯植物新品種的研發(fā)。同時(shí)，研究人員和監(jiān)管機(jī)構(gòu)也應(yīng)該幫助和促進(jìn)公眾對(duì)新技術(shù)的理解，從而提高社會(huì)認(rèn)可度。

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Genome Editing：the Opportunities and Challenges for Plant Biotechnology

Cheng Xi Wang Wenyi Qiu Jinlong
（State Key Laboratory of Plant Genomics，Institute of Microbiology，Chinese Academy of Science，Beijing 100101）

Genome editing based on sequence-specific nucleases could introduce targeted genome modifications, such as site-directed gene disruption, gene replacement or insertion in various species. As a preciseand efficient tool for genome engineering, genome editing has been extensively studied and widely applied during pastseveral years, and it would eventually change the current status of biotechnology. Genome editing system has now been established in plants, especially crops and already displayed its great potential in the field of plant biotechnology. In this review, we first briefly explain the working principles of different genome editing systems, and then list some examples of different applications of genome editing in plant research and breeding. Finally, we discuss the opportunities and challenges brought by genome editing to plant biotechnology.

sequence-specific nuclease；genome editing；plant genome engineering

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.03.016

2015-03-08

中國科學(xué)院重要方向性項(xiàng)目（KSCX2-EW-N-06），中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)（XDB11030500）

程曦，女，博士研究生，研究方向：植物和病原微生物互作；E-mail：chengx02@163.com

邱金龍，男，博士，研究員，研究方向：植物與病原微生物分子互作；E-mail：qiujl@im.ac.cn