于芬芬 季文萱 單文紅 孫艷 劉桂美 黃俊彥

近年來隨著放射影像學的快速發(fā)展和介入治療的廣泛應用，對比劑在臨床診療中的應用也越來越多，對比劑引起的對比劑腎病(contrastinduced nephropathy，CIN)也隨之逐年增多，已成為醫(yī)院獲得性腎功能不全的第3 位原因［1］。目前，CIN 的發(fā)病機制尚不明確，認為可能的機制有:血流動力學發(fā)生改變導致腎髓質缺血缺氧，對比劑對腎小管的直接毒性作用，活性氧產(chǎn)生增多導致氧化應激損傷，細胞凋亡，炎性因子等［1-2］。國內外許多研究表明，抗氧化劑可通過減少腎氧化應激對CIN 發(fā)揮保護作用［3-5］。羥苯磺酸鈣是一種微循環(huán)改善劑及抗氧化劑，廣泛應用于抗氧化治療。本實驗通過建立CIN 大鼠模型，檢測腎丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的表達及細胞凋亡情況，觀察氧化應激和細胞凋亡與CIN 的關系，并給予羥苯磺酸鈣干預，探討羥苯磺酸鈣在CIN 中的干預效果及相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

實驗動物選取體重為200 ～220 g 的清潔級、健康雄性Wistar 大鼠(購自山東魯抗實驗動物中心)。TUNEL 試劑盒購自Roche 公司，MDA、SOD、GSH-Px試劑盒購自R ﹠ D，吲哚美辛(indometacin，INDO)粉劑、N-硝基-L-精氨酸甲酯(N'-nitro-L-argininemethylesterhydrochloride，L-NAME)粉劑均購自美國Sigma 公司，76%泛影葡胺購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司，羥苯磺酸鈣購自海南林恒制藥有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CIN 大鼠模型建立及分組 將84 只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為3 組:假手術組(A 組)、模型組(B 組)和羥苯磺酸鈣干預組(C 組)，每組28 只。造模當天，B 組、C 組按文獻制備CIN 大鼠模型［6］并有所改進，具體方法如下:大鼠尾靜脈埋置留置針1 枚，每隔15 min 分別由大鼠尾靜脈注射INDO(10 mg/kg)、L-NAME(10 mg/kg)和76%泛影葡胺(10 ml/kg);A 組同樣方法注射等量的INDO、L-NAME及生理鹽水;C 組于造模前3 d 及造模當天給予羥苯磺酸鈣［100 mg/(kg·d)］［7］灌胃，A 組及B 組給予等量的生理鹽水灌胃。造模72 h 內A 組未見大鼠死亡，B 組有5 只大鼠死亡，C 組有1 只大鼠死亡。以應用對比劑48 h 或72 h 內血肌酸酐(Scr)較基礎水平升高≥25%為造模成功［1］。

1.2.2 標本收集 于造模后24 h、48 h、72 h 分批處死大鼠，每組每個時間點處死大鼠7 只，腹主動脈取血，摘取大鼠雙腎，剝離腎被膜，取1/4 腎組織于10%中性甲醛固定，其余腎組織液氮速凍后轉入－80℃冰箱凍存。

1.2.3 生化指標檢測 造模后48 h，應用日本奧林巴斯AU2700 全自動生化分析儀檢測尿素氮(BUN)、Scr。

1.2.4 病理檢查 腎組織石蠟包埋，切片，HE 染色，光鏡下觀察造模后24 h、48 h、72 h 的腎病理變化。

1.2.5 ELISA 法檢測造模后48 h 血清MDA、SOD、GSH-Px 在聚乙烯板反應孔中加入準備好的樣品及標準品，37℃反應30 min，洗板;加入酶標試劑反應30 min，洗板;加入顯色液，37℃顯色10 min，加入終止液，15 min 內讀取OD 值，繪制標準曲線，并計算樣品濃度。

1.2.6 TUNEL 檢測造模后48 h 腎細胞凋亡 中性甲醛固定腎組織，石蠟包埋，切片，脫蠟，水合，細胞通透，加TUNEL 反應液，再加入標記熒光素抗體的辣根過氧化酶，然后與二氨基苯胺(DAB)反應顯色，光學顯微鏡下觀察并計數(shù)凋亡細胞。在細胞凋亡區(qū)域，隨機選取5 個視野(×400)，以腎小管上皮細胞凋亡陽性細胞數(shù)占腎小管上皮細胞總數(shù)的百分比作為腎小管上皮細胞凋亡指數(shù)，同時設陰性對照。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有資料采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用 珋±s 表示，同一時間點不同組間比較采用單因素方差分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 生化指標檢測結果

A 組大鼠造模后各時間段血BUN、Scr 未見顯著變化，B 組和C 組大鼠造模后24 h 血BUN、Scr 顯著升高，48 h 達到高峰，至72 h 有所下降。與A 組相比，B 組大鼠造模后48 h 血Scr 升高2 倍以上，達到CIN 的診斷標準［1］;與B 組相比，C 組大鼠造模后48 h BUN、Scr 水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，但仍比A 組嚴重(表1)。

表1 各組大鼠造模后48 h 生化指標(珋±s，n=7)

表1 各組大鼠造模后48 h 生化指標(珋±s，n=7)

注:Scr，肌酸酐;BUN，尿素氮;A 組，假手術組;B 組，模型組;C組，羥苯磺酸鈣干預組;a，與A 組比較，P ＜0.05;b，與B 組比較，P ＜0.05

項目 A 組 B 組 C組Scr(μmol/L) 34.3 ±5.7 105.6 ±10.8a 66.6 ±3.1 ab BUN(mmol/L) 4.6 ±0.8 54.4 ± 2.8a 48.4 ±3.9 ab

2.2 病理變化

A 組大鼠各時間段均未見明顯病理變化;B 組和C 組大鼠造模后24 h 即出現(xiàn)腎病理損傷，造模后48 h 及72 h 病理損傷嚴重，出現(xiàn)腎小管重度玻璃樣變性、腎小球萎縮;C 組同時間段病理變化較B 組輕，但仍比A 組嚴重(圖1)。

2.3 用ELISA 法檢測造模后48 h 血清MDA、SOD、GSH-Px

與A 組相比，B 組MDA 表達顯著升高，SOD 及GSH-Px 表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);C 組MDA 表達較B 組低，SOD 及GSH-Px 表達較B 組高，但仍未達到A 組水平，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05，表2)。

表2 各組大鼠造模后48 h 血清MDA、SOD、GSH-Px 表達情況(珋±s，n=7)

表2 各組大鼠造模后48 h 血清MDA、SOD、GSH-Px 表達情況(珋±s，n=7)

注:MDA，丙二醛;SOD，超氧化物歧化酶;GSH-Px，谷胱甘肽過氧化物酶;A 組，假手術組;B 組，模型組;C 組，羥苯磺酸鈣干預組;a，與A 組比較，P ＜0.05;與B 組比較，P ＜0.05

項目 A 組 B 組 C組MDA(nmol/ml) 3.1 ±0.4 6.5 ± 0.9a 4.4 ± 0.9 ab SOD(U/ml) 91.7 ±8.1 66.2 ± 8.0a 78.9 ±11.0ab GSH-Px(U/ml) 90.8 ±7.2 55.7 ±10.4a 62.0 ±10.9 ab

圖1 HE 染色觀察各組大鼠造模后不同時間段的病理改變(×400)

2.4 TUNEL 法檢測造模后48 h 腎細胞凋亡

光學顯微鏡下觀察并計數(shù)凋亡細胞，計算腎小管上皮細胞凋亡指數(shù)(珋±s，n =7)，3 組的凋亡指數(shù)(%)分別為:A 組(0.6 ± 0.5)%，B 組(38.7 ±4.6)%，C 組(8.3 ±3.6)%。A 組腎細胞未見明顯凋亡;與A 組相比，B 組大鼠腎細胞凋亡顯著，凋亡指數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);與B組相比，C 組大鼠腎細胞凋亡明顯減輕，凋亡指數(shù)顯著降低，但仍重于A 組，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05，圖2)。

3 討論

CIN 是指在使用對比劑48 h 或72 h 內出現(xiàn)的腎損傷，通常指血Scr 絕對值升高≥44.2 μmol/L，或相對基礎水平升高≥25%，且排除其他能夠引起腎損傷的因素，血Scr 水平在3 ～5 d 達到高峰，通常在7 ～10 d 可降至基線水平［1］。目前，CIN 的發(fā)病機制尚不明確，較多研究表明，氧化應激和細胞凋亡可能參與CIN 的發(fā)病機制［3-5］。

圖2 TUNEL 檢測各組大鼠造模后48 h 腎細胞凋亡情況(如箭頭所示)×400

在正常情況下，氧化應激處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當遭遇外界刺激后，氧化作用超過還原作用，導致細胞損傷。目前認為，CIN 時氧自由基生成增多，存在氧化應激反應。氧自由基的產(chǎn)生途徑包括黃嘌呤氧化酶途徑和細胞色素氧化酶途徑，對比劑可通過改變腎血流動力學使腎內滲透壓增高，同時引起腎實質缺血缺氧，激活黃嘌呤氧化酶引起腺苷分解，導致活性氧的產(chǎn)生;另外，對比劑可通過降低腎皮質中過氧化氫酶和SOD 的活性而導致活性氧的生成增加［8］。有研究發(fā)現(xiàn)，應用對比劑后，活性氧產(chǎn)生增加，可導致和增強脂質過氧化和細胞毒性損傷，表明氧化損傷是CIN 的主要發(fā)病機制之一［9］。注射對比劑后，起的大鼠腎毒性起預防保護作用［17］。這些研究均 表明羥苯磺酸鈣可作為一種自由基清除劑，具有強產(chǎn)生的氧自由基還可與一氧化氮生成過氧亞硝酸鹽，后者更具氧化性，并且可降低一氧化氮的生物利用度，產(chǎn)生更嚴重的組織損傷［4］。MDA 是脂質氧化應激的產(chǎn)物，是反映氧化應激狀態(tài)的經(jīng)典標志物，且能夠間接反映氧自由基的生成量;清除體內氧自由基的主要系統(tǒng)是抗氧化酶系統(tǒng)，SOD 及GSH-Px 是該系統(tǒng)重要的兩個因子，SOD 能夠將超氧陰離子歧化為過氧化氫，GSH-Px 可以清除過氧化氫及脂質過氧化產(chǎn)物［5，10］。本實驗通過檢測CIN 大鼠模型中以上3 個因子的表達情況，觀察到B 組與A 組大鼠相比，MDA 顯著升高，SOD 和GSH-Px 顯著降低，進一步證實了氧化應激與CIN 的發(fā)生密切相關。

細胞凋亡，又稱細胞程序性死亡，是指細胞為維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的、有一系列酶參與的一個主動的、高度有序的死亡過程，是為更好地適應生存環(huán)境而主動死亡的過程。有研究發(fā)現(xiàn)，對比劑對腎小管具有直接毒性，腎小管上皮細胞的過度凋亡與CIN 發(fā)病機制有關［3］。本實驗發(fā)現(xiàn)，與A 組相比，B 組大鼠腎細胞凋亡明顯，細胞凋亡指數(shù)顯著升高，說明細胞凋亡可能參與CIN 的發(fā)病機制。

羥苯磺酸鈣是一種可以改善微循環(huán)的藥物，依靠其對內皮素-1(ET-1)、緩激肽等血管活性物質的影響及顯著的抗氧化作用，廣泛應用于糖尿病視網(wǎng)膜病變和慢性靜脈功能不全的治療［11-13］，也有其在氧化應激水平改善冠狀動脈旁路移植術患者缺血/再灌注損傷的研究［14］。近年來，國內外較多研究發(fā)現(xiàn)，羥苯磺酸鈣對腎疾病也具有肯定的保護作用。多項研究表明，羥苯磺酸鈣可通過保護血管內皮、抑制腎纖維化、減少纖溶酶原激活抑制因子-1(PAI-1)等機制改善糖尿病腎?。?5-16］。另有文獻報道顯示，羥苯磺酸鈣還可以通過減少氧化應激對慶大霉素引大的抗氧化作用。

本實驗通過研究羥苯磺酸鈣對CIN 大鼠生化、腎病理、氧化應激、細胞凋亡等相關指標的影響，探討羥苯磺酸鈣對CIN 的干預效果。通過HE 染色及TUNEL 染色觀察到腎損傷以腎小管最為顯著，說明對比劑主要損傷部位為腎小管上皮細胞。造模大鼠血清中MDA 表達增加，SOD 及GSH-Px 表達顯著下降，說明氧化應激可能參與CIN 的發(fā)生發(fā)展，與以往實驗結果一致［3-4］。B 組細胞凋亡顯著，表明細胞凋亡亦可能參與CIN 的發(fā)生發(fā)展。此外，C 組腎病理改變及細胞凋亡較B 組顯著減輕，且MDA 含量較B 組顯著降低，SOD 及GSH-Px 含量較B 組顯著升高，SOD 升高較GSH-Px 明顯，但尚未達到正常狀態(tài)。以上實驗結果表明，羥苯磺酸鈣能夠保護CIN大鼠的腎功能，可能機制為羥苯磺酸鈣通過增強SOD 及GSH-Px 的表達增強抗氧化系統(tǒng)，反應性減少MDA 表達，減少氧自由基生成，加快自由基清除，從而對抗氧化應激損傷;另外，羥苯磺酸鈣可能通過減少細胞凋亡發(fā)揮對CIN 模型大鼠的保護作用。

綜上所述，氧化應激和細胞凋亡可能參與CIN的發(fā)生發(fā)展，且該過程主要發(fā)生在腎小管上皮細胞。羥苯磺酸鈣可能是通過減輕CIN 大鼠氧化應激和細胞凋亡發(fā)揮腎保護作用。關于氧化應激和細胞凋亡介導CIN 發(fā)生發(fā)展的具體機制及羥苯磺酸鈣發(fā)揮腎保護作用的具體途徑有待進一步研究。

［1］Mohammed NM，Mahfouz A，Achkar K，et al. Contrast-induced Nephropathy. Heart Views，2013，14:106-116.

［2］Golshahi J， Nasri H， Gharipour M. Contrast-induced nephropathy;A literature review. J Nephropathol，2014，3:51-56.

［3］Buyuklu M，Kandemir FM，Ozkaraca M，et al. Protective effect of curcumin against contrast induced nephropathy in rat kidney:what is happening to oxidative stress，inflammation，autophagy and apoptosis?Eur Rev Med Pharmacol Sci，2014，18:461-470.

［4］Ari E，Kedrah AE，Alahdab Y， et al. Antioxidant and renoprotective effects of paricalcitol on experimental contrastinduced nephropathy model. Br J Radiol，2012，85:1038-1043.

［5］Kongkham S，Sriwong S，Tasanarong A. Protective effect of alpha tocopherol on contrast-induced nephropathy in rats. Nefrologia，2013，33:116-123.

［6］Wu CT，Weng TI，Chen LP，et al. Involvement of caspase-12-dependent apoptotic pathway in ionic radiocontrast urografininduced renal tubular cell injury. Toxicol Appl Pharmacol，2013，266:167-175.

［7］謝泉琨，劉曉城. 羥苯磺酸鈣對2 型糖尿病模型大鼠腎臟氧化應激的影響. 中國藥房，2004，15:721-723.

［8］唐露，魏日胞，耿文佳，等. 對比劑腎病發(fā)病機制及干預措施的研究進展.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2013，7:3062-3064.

［9］Heyman SN，Rosen S，Khamaisi M，et al. Reactive oxygen species and the pathogenesis of radiocontrast-induced nephropathy.Investig Radiol，2010，45:188-195.

［10］Zhu SY，Dong Y，Tu J，et al. Silybum marianum oil attenuates oxidative stress and ameliorates mitochondrial dysfunction in mice treated with D-galactose. Pharmacogn Mag，2014，10(Suppl 1):S92-S99.

［11］Garay RP，Hannaert P，Chiavaroli C. Calcium dobesilate in the treatment of diabetic retinopathy.Treat Endocrinol，2005，4:221-232.

［12］Javadzadeh A，Ghorbanihaghjo A，Adl FH，et al. Calcium dobesilate reduces endothelin-1 and high-sensitivity C-reactive protein serum levels in patients with diabetic retinopathy. Mol Vis，2013，19:62-68.

［13］Alda O，Valero MS，Pereboom D，et al. In vitro effect of calcium dobesilate on oxidative/inflammatory stress in human varicose veins. Phlebology，2011，26:332-337.

［14］Cerrahoglu M，Taner Kurdal A，Iskesen I，et al. Calcium dobesilate reduces oxidative stress in cardiac surgery. J Cardiovasc Surg (Torino)，2009，50:695-701.

［15］高美娟，劉明，李波，等. 羥苯磺酸鈣對早期糖尿病腎病大鼠腎臟的保護作用. 藥學學報，2009，44:126-133.

［16］Zhang X. Therapeutic effects of calcium dobesilate on diabetic nephropathy mediated through reduction of expression of PAI-1.Exp Ther Med，2013，5:295-299.

［17］Jafarey M，Changizi Ashtiyani S，Najafi H. Calcium dobesilate for prevention of gentamicin-induced nephrotoxicity in rats. Iran J Kidney Dis，2014，8:46-52.