劉莉莉+王成

摘 要：選取水體中廣泛存在的四尾柵藻為代表，研究其在營(yíng)養(yǎng)鹽限制條件下對(duì)壬基酚脅迫的響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)暴露組（0.041、0.103、0.205mg·L-1）和1個(gè)對(duì)照組（0mg·L-1），測(cè)定了96h內(nèi)四尾柵藻細(xì)胞密度、胞外多糖合成、最大光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）以及群體形態(tài)等變化。結(jié)果顯示，隨著NP暴露濃度的增加，四尾柵藻的密度、Fv/Fm 等指標(biāo)的下降幅度更加顯著；0.041mg·L-1NP暴露對(duì)四尾柵藻的生長(zhǎng)、葉綠素a含量以及Fv/Fm等均有促進(jìn)作用，說(shuō)明四尾柵藻在NP暴露下能夠產(chǎn)生毒物刺激效應(yīng)現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞：壬基酚；四尾柵藻；脅迫；毒性效應(yīng)

中圖分類號(hào) X592 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2015）12-24-04

Study on Scenedesmus quadricanda Responses to Nonylphenol Stress

Liu Lili1 et al.

（1 Jianghuai College of Anhui University，Hefei 230031，China）

Abstract：In order to study the physiological effects of NP on the fresh algae，Scenedesmus quadricanda was exposed to NP of three concentrations（0.041、0.103、0.205mg·L-1） and a control（0mg·L-1） . Its cell number、maximum light conversion efficiency （Fv/Fm） 、extracellular polysaccharide and cell morphology were measured in 96h exposure. Results show that the cell number and Fv/Fm of microalgae were increased in 0.041mg·L-1 NP ，with the increasing of concentrations of NP， the cell number and Fv/Fm of microalgae were decreased，the growth of Scenedesmus quadricanda was inhibited.

Key words：Nonylphenol；Scenedesmus quadricanda；Stress；Toxic effect

壬基酚（Nonylphenol，NP），分子式C15H24O，由苯環(huán)和9個(gè)碳原子的碳鏈組成，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用，中國(guó)年產(chǎn)量約為30 300t，其中的60%會(huì)排入污水處理系統(tǒng)并最終排入水環(huán)境中[1]。近年來(lái)，我國(guó)一些重要的自然水體中均已發(fā)現(xiàn)NP的存在，并且由于其不易降解的特性導(dǎo)致環(huán)境中的NP含量不斷累積[2]。水域生態(tài)系統(tǒng)主要初級(jí)生產(chǎn)力淡水微藻對(duì)水域生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定起著十分重要的作用，因其個(gè)體小、繁殖快、對(duì)毒物敏感等特點(diǎn)，已成為評(píng)價(jià)水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)[3]。在富營(yíng)養(yǎng)化的淡水水域中，四尾柵藻（Scenedesmus quadricanda）是常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)藻種之一[4]。

目前，在淡水微藻室內(nèi)毒理實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，BG11是常用的淡水藻類培養(yǎng)基，其ρ（TN）和ρ（TP）分別為247.06mg·L-1和7.11mg.L-1，而在自然水體ρ（TN）、ρ（TP）濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于培養(yǎng)基[5-6]。本文主要研究在近似水體營(yíng)養(yǎng)鹽條件下四尾柵藻對(duì)壬基酚脅迫的響應(yīng)，包括四尾柵藻細(xì)胞密度、最大光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）、胞外多糖含量以及細(xì)胞群體形態(tài)的變化，以期為合理評(píng)價(jià)該類污染物對(duì)水域生態(tài)系統(tǒng)的影響提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 5401-CC275TL型智能人工氣候箱，UV-2450型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，Handy PEA植物效率分析儀等。壬基酚純品購(gòu)自上海晶純實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 藻種及培養(yǎng)條件 實(shí)驗(yàn)藻種四尾柵藻由暨南大學(xué)水生生物研究所藻種室提供，培養(yǎng)溫度為（23±1）℃，光照強(qiáng)度100μmol·m-2·s-1，光暗比為12h（L）∶12h（D）。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用營(yíng)養(yǎng)鹽濃度減少為原濃度1/10的BG-11培養(yǎng)基。無(wú)菌條件下，將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的四尾柵藻離心（3 500rpm，5min，24℃），經(jīng)無(wú)菌蒸餾水反復(fù)清洗后接種于1/10的BG-11培養(yǎng)基中，靜置饑餓4d后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)采用丙酮作為助溶劑，配制丙酮的6個(gè)體積濃度系列：0、1、3、5、7和10‰，96h培養(yǎng)后用血球計(jì)數(shù)板顯微計(jì)數(shù)，測(cè)定藻細(xì)胞的密度，計(jì)算得到丙酮對(duì)四尾柵藻不可見(jiàn)效應(yīng)劑量（No observed effect level，NOEL）為5‰。將預(yù)處理過(guò)的藻液接種到1/10 BG-11培養(yǎng)基中，接種密度為8.63×105cells·mL-1。NP質(zhì)量濃度分別為0（加5‰丙酮作為對(duì)照）、0.041、0.103和0.205mg·L-1。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，每天搖瓶至少3次，培養(yǎng)96h。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 藻細(xì)胞密度的測(cè)定 每隔24h取樣，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3次，取其平均值。

1.4.2 最大光能轉(zhuǎn)化效率的測(cè)定 每隔24h取樣，測(cè)量前將待測(cè)藻液暗適應(yīng)20min。利用Handy PEA植物效率分析儀測(cè)定最大光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）。

1.4.3 胞外多糖含量的測(cè)定 每隔24h取樣，將藻液通過(guò)0.45μm濾膜過(guò)濾，吸取2.0mL濾液加入25mL比色管中，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)，用硫酸苯酚法測(cè)定胞外多糖的含量[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 四尾柵藻細(xì)胞密度變化對(duì)NP暴露的響應(yīng) 不同質(zhì)量濃度NP對(duì)四尾柵藻的細(xì)胞密度的影響如圖1。由圖1可知，四尾柵藻細(xì)胞起始密度為8.63×105cells·mL-1，在培養(yǎng)過(guò)程中，NP質(zhì)量濃度為0.041mg·L-1處理組細(xì)胞密度始終均比同期對(duì)照組高，藻細(xì)胞數(shù)量顯著增加，最終為對(duì)照組的1.13倍，差異顯著（P<0.05）；在0.103mg·L-1NP處理組中藻細(xì)胞密度相比對(duì)照組無(wú)顯著差異（P>0.05）。在96h后，0.205mg·L-1NP暴露會(huì)抑制藻細(xì)胞數(shù)量的增加，顯著低于對(duì)照組（P<0.05），為對(duì)照組的74%。表明低濃度的NP對(duì)四尾柵藻的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，高濃度的NP抑制了四尾柵藻的生長(zhǎng)，0.205mg·L-1NP處理組藻體顏色相比處理組變淺。

2.2 四尾柵藻最大光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）對(duì)NP暴露的響應(yīng) NP暴露對(duì)四尾柵藻Fv/Fm的影響如圖2所示。由圖2可知：96h后，0.041mg·L-1NP處理組明顯提高了四尾柵藻光系統(tǒng)（PSⅡ）的Fv/Fm（n=3，P<0.05），0.103、0.205mg·L-1NP處理則降低了四尾柵藻的Fv/Fm。

2.3 四尾柵藻胞外多糖合成對(duì)NP暴露的響應(yīng) 如圖3所示，培養(yǎng)結(jié)束后，0.205mg·L-1處理組四尾柵藻細(xì)胞胞外多糖含量最高，為對(duì)照組的1.05倍，0.041mg·L-1處理組中細(xì)胞胞外多糖含量低于對(duì)照組，且始終低于同期對(duì)照組。

2.4 NP暴露對(duì)四尾柵藻群體形成的影響 不同質(zhì)量濃度NP對(duì)四尾柵藻細(xì)胞群體形態(tài)的影響如圖4所示。由圖4可知，實(shí)驗(yàn)初始階段，對(duì)照組和處理組中四尾柵藻單細(xì)胞、雙細(xì)胞和多細(xì)胞群體形態(tài)相對(duì)比例為69.2%、22.78%、0.08%，培養(yǎng)期間，NP質(zhì)量濃度0.041mg·L-1處理組中四尾柵藻非單細(xì)胞群體相對(duì)比例基本均低于對(duì)照組；而0.102、0.205mg·L-1處理組中非單細(xì)胞群體相對(duì)比例在96h后分別比對(duì)照組高出3.4%、14.1%。

3 結(jié)論與討論

NP對(duì)生物的影響是多方面的，通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)研究表明，低濃度（0.041mg·L-1）的NP對(duì)四尾柵藻的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，細(xì)胞密度與對(duì)照組相比也有所增加，F(xiàn)v/Fm也有所提高。Fv/Fm反映的是PSII反應(yīng)中心原初光能轉(zhuǎn)化效率，即最大光化學(xué)效率，可以反應(yīng)植物所受脅迫程度以及植物的光合效能[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低質(zhì)量濃度（0.041mg·L-1）NP暴露促進(jìn)了四尾柵藻藻Fv/Fm的升高，這與王山杉等人在固氮魚(yú)腥藻的研究相一致[9]。所以低質(zhì)量濃度NP對(duì)四尾柵藻生長(zhǎng)的刺激效應(yīng)，很可能是因?yàn)镹P暴露提高了微藻的Fv/Fm，促進(jìn)了細(xì)胞中光合色素和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的轉(zhuǎn)化合成，從而刺激了微藻細(xì)胞相對(duì)較快的增長(zhǎng)繁殖，致使單個(gè)細(xì)胞所負(fù)擔(dān)污染物濃度降低，且受損藻細(xì)胞逐漸恢復(fù)的結(jié)果。

而在NP暴露濃度為0.205mg·L-1的處理組中，柵藻細(xì)胞中雙細(xì)胞、多細(xì)胞群體明顯增多，與單細(xì)胞相對(duì)比例增大，高于對(duì)照組。四尾柵藻群體特征的出現(xiàn)，說(shuō)明原先的單細(xì)胞表面的黏性增強(qiáng)，也就是說(shuō)與細(xì)胞表面粘性有關(guān)的胞外多糖含量可能增高了。而本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)過(guò)程中四尾柵藻細(xì)胞胞外多糖合成的變化也證實(shí)了這一點(diǎn)，處理組中藻細(xì)胞胞外多糖含量顯著高于對(duì)照組。可見(jiàn)，四尾柵藻群體的形成與胞外多糖分泌量密切相關(guān)，與楊州在銅綠微囊藻中的研究相一致[10]。由于藻類群體的形成，減小了其比表面積和包裹效應(yīng)（package-effect）的影響，使得藻類群體單位體表面積吸收的光能減少[11]，影響了光合作用的進(jìn)行；同時(shí)，群體形態(tài)的維持需要更多的能量用于合成胞外多糖，減少了其他成分（如蛋白質(zhì)、脂肪）的合成量，從而不利于細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)[12]。實(shí)驗(yàn)測(cè)定的細(xì)胞密度和Fv/Fm的變化也證實(shí)了這一點(diǎn)。

低濃度NP暴露對(duì)四尾柵藻的生長(zhǎng)、葉綠素a含量以及Fv/Fm等均有促進(jìn)作用，這表明四尾柵藻可以通過(guò)在身代謝的調(diào)整來(lái)適應(yīng)低濃度的NP脅迫，低濃度的NP對(duì)四尾柵藻產(chǎn)生了毒物刺激效應(yīng)現(xiàn)象，在一定程度上促進(jìn)了四尾柵藻細(xì)胞的代謝活動(dòng)，增強(qiáng)了其光合作用效能，其中的促進(jìn)機(jī)理有待于進(jìn)一步的研究。

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（責(zé)編：張宏民）