趙忠濤+張麗+李超

摘要：采用盆栽方法研究了不同濃度Cu2+、Zn2+脅迫對(duì)早熟禾（Poa pratensis L.）品種潤(rùn)草1號(hào)（P. pratensis cv. Runcao No.1）生理特性的影響。通過檢測(cè)潤(rùn)草1號(hào)葉片的葉綠素、脯氨酸含量和細(xì)胞膜透性，以及根系活力的變化，發(fā)現(xiàn)低濃度的Cu2+、Zn2+刺激了潤(rùn)草1號(hào)的生長(zhǎng)，提高了葉片的葉綠素含量以及根系活力；但高濃度的Cu2+、Zn2+能夠?qū)е聺?rùn)草1號(hào)葉片的葉綠素含量、根系活力不同程度地下降。

關(guān)鍵詞：早熟禾（Poa pratensis L.）；重金屬；脅迫；生理特性

中圖分類號(hào)：S688.4+78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）02-0295-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.02.023

在自然界里，重金屬元素很難被生物體降解，并且重金屬元素還可以在食物鏈的傳遞下，在生物體內(nèi)層層富集，造成嚴(yán)重的生態(tài)危害。土壤中重金屬元素的污染可能會(huì)導(dǎo)致土壤肥力的降低與流失、作物產(chǎn)量降低和品質(zhì)劣化、水環(huán)境污染加重等嚴(yán)重后果。因此，如何修復(fù)土壤的重金屬元素污染，是環(huán)境和生態(tài)保護(hù)所亟待破解的重大課題之一。而在重金屬元素污染較重的區(qū)域種植耐受性較高的植物，特別是非食用性的耐受性較高的植物，是非常有效的恢復(fù)生態(tài)環(huán)境的途徑之一[1，2]。銅（Cu2+）和鋅（Zn2+）是植物生長(zhǎng)所必需的元素之一。在正常的生理狀態(tài)下，植物體對(duì)于Cu2+和Zn2+的吸收主要是通過主動(dòng)吸收過程來實(shí)現(xiàn)。但植物對(duì)于Cu2+和Zn2+的主動(dòng)吸收過程是受到代謝調(diào)控的。當(dāng)Cu2+和Zn2+的濃度超過一定限度時(shí)，會(huì)對(duì)植物體產(chǎn)生不良影響。輕的會(huì)使植物體正常的代謝功能發(fā)生紊亂，妨礙植物體的正常生長(zhǎng)發(fā)育；嚴(yán)重情況下甚至導(dǎo)致植物體的死亡。某些植物在長(zhǎng)期的自然選擇或人工篩選下，獲得了某些特異的代謝功能，使得植物能夠在重金屬含量較高的環(huán)境中正常生長(zhǎng)，這就是植物的重金屬耐受性[3]。早熟禾（Poa pratensis L.）主要適宜于南方地區(qū)露地栽培，是草坪綠化常用的地被植物之一。其主要用于觀賞草坪的建植，對(duì)于降低環(huán)境污染、完善城市綠化及美化起著非常重要的作用[4]。潤(rùn)草1號(hào)（P. pratensis cv. Runcao No.1）是一個(gè)新選育的早熟禾品種，于2012年由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院培育而成。潤(rùn)草1號(hào)屬于低矮型草坪草，坪用性狀優(yōu)良，具有較強(qiáng)的耐蔭、耐熱性能，抗倒伏和抗病能力強(qiáng)。試驗(yàn)以潤(rùn)草1號(hào)為材料，研究了其在不同濃度的重金屬元素Cu2+和Zn2+脅迫下生理生化指標(biāo)的變化規(guī)律，以期為今后開發(fā)利用潤(rùn)草1號(hào)用于Cu2+和Zn2+污染的土壤修復(fù)提供理論依據(jù)，并為潤(rùn)草1號(hào)在城市園林的廣泛應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試草地早熟禾品種潤(rùn)草1號(hào)由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院提供，供試土壤取自學(xué)院花房土質(zhì)較好的表層土壤，Cu2+添加形式為CuSO4，Zn2+添加形式為ZnCl2，均為分析純。

1.2 處理設(shè)置

室外盆栽試驗(yàn)于2014年9月至2014年11月在江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)施。供試土壤風(fēng)干后過0.5 cm篩，按照1∶3將草炭土和土壤混合配制，并稱重5.0 kg裝入花盆中，然后定植潤(rùn)草1號(hào)。15 d后，分別澆灌Cu2+和Zn2+溶液。以不使用Zn2+、Cu2+處理作為對(duì)照，Zn2+、Cu2+濃度梯度均設(shè)置為5、10、20、50、100 mg/kg，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 葉綠素含量的測(cè)定 稱取新鮮葉片0.2 g于研缽中，加入少量碳酸鈣粉和石英砂，再加入2～3 mL的95%乙醇，研磨成勻漿。濾紙過濾到25 mL棕色容量瓶中，并用少量乙醇處理研缽、研棒、殘?jiān)蜑V紙上的葉綠體色素，直至濾紙和殘?jiān)袩o(wú)綠色為止。乙醇定容，搖勻。將提取液倒入比色杯內(nèi)，以95%乙醇為空白，分別在665、649、470 nm處測(cè)定吸光度。平行重復(fù)3組[5]。

1.3.2 脯氨酸含量的測(cè)定 取剪碎混勻的新鮮葉片0.2 g置于大試管中，加入5 mL 3%磺基水楊酸溶液；管口加蓋玻璃球，于沸水浴中浸提15 min。待冷卻至室溫后，吸取上清液2 mL，加2 mL冰乙酸和3 mL茚三酮顯色液，于沸水浴中加熱15 min。冷卻后加入5 mL甲苯，搖勻萃取，避光靜置待完全分層。用移液槍吸取甲苯層液體于石英比色皿中，于520 nm處測(cè)定吸光度，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出脯氨酸含量。平行重復(fù)3組[5]。

1.3.3 細(xì)胞膜透性的測(cè)定 選取新鮮葉片若干，吸干水分后剪下，拭凈，用電子天平稱取2份，各重2 g。1份放入40 ℃恒溫箱內(nèi)萎蔫1 h，另1份放在燒杯中在室溫下做對(duì)照。處理后分別用去離子水沖洗，準(zhǔn)確加人20 mL去離子水浸沒葉片。用真空抽氣泵抽氣7～8 min，使細(xì)胞中的空氣被抽出，將葉片全部浸人去離子水中。在室溫下靜置20 min，然后用DDS-11D型電導(dǎo)率儀測(cè)定溶液的電導(dǎo)率R1；再將其置于沸水浴中煮沸15 min，冷卻后測(cè)定其電導(dǎo)率R2，計(jì)算出相對(duì)電導(dǎo)率，以此表示細(xì)胞膜透性。平行重復(fù)3組[5]。

1.3.4 根系活力的測(cè)定 取新鮮根樣品0.5 g放入燒杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸緩沖液的等量混合液10 mL，把根充分浸沒，在37 ℃下暗處保溫1 h。然后加入1 mol/L硫酸2 mL，以停止反應(yīng)。把根取出，吸干后與乙酸乙酯3～4 mL和少量石英砂一起研磨。將紅色提取液以乙酸乙酯洗滌2～3次，最后加乙酸乙酯定容至10 mL。在485 nm處比色，以空白處理作為參比讀出吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出四氮唑還原量，以此表示根系活力。平行重復(fù)3組[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu2+和Zn2+脅迫下潤(rùn)草1號(hào)葉片中葉綠素含量的變化

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的關(guān)鍵因素之一，葉綠素含量水平在一定程度上可以反映植物光合作用能力的強(qiáng)弱；4種不同濃度的Cu2+和Zn2+溶液脅迫對(duì)葉綠素含量的作用效果見圖1。從圖1可見，在Cu2+和Zn2+溶液處理之后，潤(rùn)草1號(hào)葉片中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量隨著Cu2+和Zn2+溶液濃度的升高均呈現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢(shì)。低濃度的Cu2+和Zn2+處理后，葉綠素含量上升；但當(dāng)Cu2+濃度≥20 mg/kg或者Zn2+濃度≥50 mg/kg后，葉片中葉綠素含量呈下降趨勢(shì)。這說明銅和鋅是潤(rùn)草1號(hào)必需的營(yíng)養(yǎng)元素，在低濃度下，Cu2+和Zn2+對(duì)于潤(rùn)草1號(hào)生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用。但高濃度的Cu2+和Zn2+卻會(huì)影響到潤(rùn)草1號(hào)葉片中葉綠素的合成，產(chǎn)生了脅迫作用，葉片色素對(duì)Cu2+和Zn2+污染的敏感程度高低排序?yàn)槿~綠素b、葉綠素a、類胡蘿卜素。

在高濃度的Cu2+和Zn2+脅迫下，潤(rùn)草1號(hào)體內(nèi)的葉綠素含量呈下降趨勢(shì)。Cu2+和Zn2+導(dǎo)致潤(rùn)草1號(hào)葉片中葉綠素含量下降的原因可能有多種，推測(cè)是Cu2+和Zn2+被植物吸收后，細(xì)胞內(nèi)的Cu2+和Zn2+離子作用于葉綠素生成途徑的酶；Cu2+和Zn2+離子通過改變?nèi)~綠素合成相關(guān)酶的正常構(gòu)型，抑制了相關(guān)酶的活性，進(jìn)而阻礙了葉綠素的合成。有研究表明，早熟禾葉片對(duì)光的吸收能力源于其中的葉綠體，而葉綠體的變化過程與葉綠素含量、光合速率降低及其結(jié)構(gòu)的破壞密切相關(guān)[6]。因此，在重金屬脅迫處理后，會(huì)造成葉綠素含量下降及結(jié)構(gòu)被破壞，進(jìn)而影響光合反應(yīng)效率，甚至可能影響植物的光合系統(tǒng)、保護(hù)酶系統(tǒng)以及物質(zhì)代謝系統(tǒng)，改變植物正常生理狀態(tài)，最終導(dǎo)致植物死亡。

2.2 Cu2+和Zn2+脅迫下潤(rùn)草1號(hào)葉片中脯氨酸含量的變化

脯氨酸是植物體內(nèi)調(diào)節(jié)滲透平衡的重要物質(zhì)，在維持細(xì)胞滲透壓方面起著重要的作用，并且植物體內(nèi)的脯氨酸含量可以用作植物對(duì)外界環(huán)境重金屬脅迫響應(yīng)的重要指標(biāo)之一[7]；4種不同濃度的Cu2+和Zn2+溶液脅迫對(duì)葉片脯氨酸含量的作用效果見圖2。從圖2可以看出，在Cu2+和Zn2+脅迫下，潤(rùn)草1號(hào)葉片內(nèi)脯氨酸的含量隨著Cu2+和Zn2+濃度的升高不斷上升，在Cu2+和Zn2+處理濃度為100 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值，分別為對(duì)照的2倍和2.3倍，而且各處理與對(duì)照之間差異明顯。

2.3 Cu2+和Zn2+脅迫下潤(rùn)草1號(hào)葉片細(xì)胞膜透性的變化

植物細(xì)胞膜系統(tǒng)是植物細(xì)胞和外界環(huán)境相隔離的屏障，也行使著細(xì)胞與外界環(huán)境傳遞信息和交換物質(zhì)的功能，并且細(xì)胞膜的穩(wěn)定性是維持細(xì)胞內(nèi)外平衡和正常生理功能的基礎(chǔ)[8]。重金屬脅迫可以破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增加。細(xì)胞膜透性的變化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜上結(jié)合酶和細(xì)胞內(nèi)酶的失調(diào)，使細(xì)胞內(nèi)外平衡性喪失，造成一系列生理生化過程紊亂，甚至出現(xiàn)植株死亡[9]。試驗(yàn)里在Cu2+和Zn2+脅迫處理下，潤(rùn)草1號(hào)葉片組織外滲液的相對(duì)電導(dǎo)率隨Cu2+和Zn2+濃度的增加而升高，呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。其原因可能是Cu2+和Zn2+進(jìn)入潤(rùn)草1號(hào)葉片后，與細(xì)胞膜蛋白的巰基或磷脂分子層的磷脂類物質(zhì)反應(yīng)，造成膜蛋白的磷脂結(jié)構(gòu)改變。而磷脂結(jié)構(gòu)的改變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變，使得細(xì)胞膜透性增大，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外滲，從而引起相對(duì)電導(dǎo)率的變化[3，10]。

2.4 Cu2+和Zn2+脅迫對(duì)潤(rùn)草1號(hào)根系活力的影響

對(duì)于草坪植物來說，發(fā)達(dá)的根系對(duì)于植物抵御外力侵蝕和雨水沖刷、保持水土具有重要的作用。而土壤中的重金屬污染最主要的影響就是危害植物根系，可能導(dǎo)致根系活力降低和主動(dòng)吸收能力下降[11]；4種不同濃度的Cu2+和Zn2+溶液脅迫對(duì)潤(rùn)草1號(hào)根系活力的影響情況見圖4。從圖4可見，在低濃度的Cu2+和Zn2+處理下，潤(rùn)草1號(hào)根系活力均有升高。在Cu2+和Zn2+處理濃度為5 mg/kg時(shí)，根系活力最高，分別比對(duì)照提高了70.3%和24.1%，與對(duì)照的差異明顯。當(dāng)Zn2+濃度≥50 mg/kg、Cu2+濃度≥20 mg/kg時(shí)，潤(rùn)草1號(hào)根系活力開始下降。在Zn2+、Cu2+處理濃度為100 mg/kg時(shí)，根系活力最低，分別為對(duì)照的52.7%和26.5%，與對(duì)照差異明顯。由圖4還可見，低濃度的Cu2+和Zn2+（<20 mg/kg）能夠提高潤(rùn)草1號(hào)根系活力，這表明低濃度的Cu2+和Zn2+對(duì)潤(rùn)草1號(hào)根系的生長(zhǎng)及生理具有一定的促進(jìn)效果；但當(dāng)Cu2+和Zn2+的處理濃度為20 mg/kg后，潤(rùn)草1號(hào)的根系活力則呈下降趨勢(shì)，濃度越高，根系活力越低。究其原因可能是高濃度的Cu2+和Zn2+脅迫后，產(chǎn)生的自由基超過潤(rùn)草1號(hào)自身抗氧化系統(tǒng)酶的清除能力，多余的自由基會(huì)對(duì)潤(rùn)草1號(hào)根系代謝中的琥珀酸脫氫酶等造成傷害，從而使根系活力下降[11]。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，Cu2+和Zn2+脅迫處理對(duì)潤(rùn)草1號(hào)初期生長(zhǎng)的影響并不完全一致。高濃度的Cu2+對(duì)葉綠素含量、脯氨酸含量、細(xì)胞膜透性及根系活力抑制作用明顯，并且這種抑制作用均隨著Cu2+脅迫濃度的增加而增強(qiáng)，對(duì)根系生長(zhǎng)的抑制尤其明顯。Zn2+脅迫處理對(duì)葉綠素含量、脯氨酸含量、細(xì)胞膜透性及根系活力的影響與Cu2+有相似之處。但是Zn2+脅迫的抑制程度要明顯小于Cu2+處理。

葉綠素含量的多少在一定程度上反映了植物光合作用的強(qiáng)弱，也直接影響著草坪植物的綠度。試驗(yàn)中2種重金屬Cu2+和Zn2+對(duì)潤(rùn)草1號(hào)葉片中葉綠素的影響表現(xiàn)出相類似的規(guī)律，當(dāng)處理濃度低于20 mg/kg時(shí)，Cu2+和Zn2+對(duì)葉綠素合成具有促進(jìn)作用，葉片中的葉綠素含量比對(duì)照有所增加；當(dāng)處理濃度等于20 mg/kg時(shí)，Cu2+和Zn2+對(duì)葉綠素合成具有抑制作用，葉片中的葉綠素含量隨處理濃度的增加而減少。個(gè)中原因可能是高濃度的Cu2+和Zn2+會(huì)抑制潤(rùn)草1號(hào)合成葉綠素途徑的關(guān)鍵酶活性，影響葉綠素的合成，導(dǎo)致了葉片中葉綠素含量的下降[12]。

草坪植物綠度與根系生長(zhǎng)是衡量草坪植株是否具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的最為重要的指標(biāo)之一，而高濃度的Cu2+和Zn2+對(duì)“根系生長(zhǎng)的抑制作用尤為明顯。因此，在實(shí)際使用中，建議草坪土壤中的Cu2+含量應(yīng)控制在10 mg/kg以下，Zn2+含量可以控制在20 mg/kg以下，以利于潤(rùn)草1號(hào)植株的正常生長(zhǎng)。

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