李相怡　方曦　任皓威　程琳　張拓　付國紅　劉寧

摘 要 通過體外模擬新生兒消化道條件，用基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法（MALDI-TOF/TOF）探究人乳β-酪蛋白消化后的多肽組。在離子源加速電壓為20 kV，激光波長337 nm，激光頻率200 Hz，離子延遲提取時間330 ns，質(zhì)譜信號單次掃描累加2000次條件下，掃描質(zhì)量范圍m/z 500～ 5000的肽段。結(jié)果表明，消化后得到26個肽段，分子量集中在1000～4000 Da。與已知功能的肽段序列進(jìn)行對比，人乳β-酪蛋白在新生兒體外模型消化后未產(chǎn)生與已知功能的活性肽序列匹配的肽段，但發(fā)現(xiàn)9個肽前體，其中含4個血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 （ACE）抑制肽前體，2個酪蛋白磷酸肽（CPP）前體，2個抗氧化肽前體，1個免疫活性肽前體，由酶切位點(diǎn)推測分析，肽前體可以繼續(xù)在蛋白酶作用下轉(zhuǎn)化為生物活性肽。

關(guān)鍵詞 β-酪蛋白； 新生兒； 體外消化； 多肽組； 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜

1 引 言

多肽組（Peptidome）是指器官、組織、細(xì)胞和體液中全部內(nèi)源性多肽組分，包括生物體內(nèi)具有特殊功能的活性多肽和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的多肽【1～3】，多肽組學(xué)（peptidomics）研究的是多肽組的成分、功能、變化規(guī)律及其相關(guān)關(guān)系【2】，已應(yīng)用于人體體液多肽組分析【4，5】。人乳以富含多種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)以及活性肽等優(yōu)點(diǎn)被公認(rèn)是新生兒最好的食品，其中β-酪蛋白的含量為30%～35%【6～8】，是人乳中比重最大的酪蛋白【9，10】。本課題組在人乳β-酪蛋白（尤其是中國人乳β-酪蛋白）的鑒定和結(jié)構(gòu)功能方面已開展了前期研究【11～13】。目前， 關(guān)于人乳β-酪蛋白的研究集中于對其消化產(chǎn)物的分離、鑒定和生物學(xué)功能方面【14～17】，還沒有針對人乳β-酪蛋白消化后多肽組學(xué)的報道，而研究人乳β-酪蛋白消化后的多肽組可以為日后研發(fā)更適合嬰幼兒的配方食品提供參考。嬰兒（≤12月齡）尤其是新生兒（≤28日齡）的消化系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，代謝旺盛，但蛋白酶活性很低，胃蛋白酶活性和分泌量與嬰兒生長發(fā)育的時間成正相關(guān)，而胰蛋白酶的活性以及分泌量在3～24月齡時也低于成年人【18，19】。本研究在普遍使用的嬰兒體外消化方法【20】基礎(chǔ)上，根據(jù)新生兒蛋白酶活性低的特點(diǎn)，建立了更適合研究新生兒體外消化的模型。以此模型消化人乳β-酪蛋白，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法分析其消化產(chǎn)物多肽組。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

GL-21M高速冷凍離心機(jī)（上海離心機(jī)械研究所）； Delta320型pH計(jì)和AL204精密電子天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）； 真空冷凍干燥機(jī)（上海醫(yī)用儀器廠）； DYY-10C型電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（北京六一儀器）； 凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-RAD公司）； 蛋白質(zhì)純化儀AKTA purifer 100（美國GE公司）； AB4700 MALDI TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Applied Biosystems公司）。

DEAE-Sepharose Fast Flow葡聚糖凝膠（美國GE公司）； ziptip C18層析柱（美國GE公司）； 人乳采自中國漢族人乳； 胃蛋白酶、胰蛋白酶、尿素 （美國Sigma公司）； 預(yù)染蛋白Marker（美國Thermo scientific公司）； 30 %聚丙烯酰胺（北京Solarbio公司）； 兔抗人β-酪蛋白抗體（美國Abcam公司）； 增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒（Tiangen公司）。其它試劑均為分析純； 實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 人乳β-酪蛋白的純化與鑒定 參照文獻(xiàn)＼低以及酶添加量很少。但含9個肽前體（肽前體是在特定

環(huán)境下，經(jīng)蛋白酶消化可以轉(zhuǎn)化為生物活性肽的多肽），其中酪蛋白磷酸肽前體2個，抗氧化肽前體2個，ACE抑制肽前體4個，免疫活性肽前體1個，各種多肽的功能分布見圖4B。在圖4C中，根據(jù)存在的酶切位點(diǎn)推測肽前體可以在胃蛋白酶或者羧肽酶B等作用下轉(zhuǎn)化成活性肽（除黑色外，其它顏色的部分為活性肽序列），如第一個CPP前體可被蛋白酶K消化成CPP。

4 結(jié) 論

新生兒體外消化模型消化人乳β-酪蛋白，獲得人乳β-酪蛋白多肽組數(shù)據(jù)，模擬胃消化得到9個肽段，模擬小腸消化得到6個肽段，模擬胃腸連續(xù)消化得到11個肽段。實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)與已知功能活性肽序列匹配的肽段； 但發(fā)現(xiàn)有9個肽前體，其中CCP肽前體2個，抗氧化肽前體2個，ACE抑制肽前體4個，免疫活性肽前體1個，由酶切位點(diǎn)推測分析肽前體可以繼續(xù)在蛋白酶作用下轉(zhuǎn)化為生物活性肽。這些多肽可能具有促進(jìn)新生兒腸道菌群的建立及腸黏膜的發(fā)育等功能，具體的功能有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)探究。

References

1 Schrader M， Schulz-Knappe P. Trends Biotechnol.， 2001， 19（10）： 55-60

2 Schulz-Knappe P， Schrader M， Zucht H D. Comb. Chem. & High Throughput Screening， 2005， 8（8）： 697-704

3 Ji L， Barrett T， Ayanbule O， Troup DB， Rudnev D， Muertter R N， Tomashevsky M， Soboleva A， Slotta D J. Nucleic Acids Res.， 2010， 38（database）： 731-735

4 Zougman A， Pilch B， Podtelejnikov A， Kiehntopf M， Schnabel C， Kumar C， Mann M. J Proteome Res.， 2008， 7（1）： 386-399endprint

5 Wan J， Cui X W， Zhang J， Fu Z Y， Guo X R， Sun L Z， Ji C B. Biochem. Biophys. Res. Commun.， 2013， 438（1）： 236-241

6 Hambraeus L， Lonnerdal B， Forsum E M， Gebre-medhin M. Acta. Paediatr. Scand.， 1978， 67（5）： 561-565

7 ZHANG Lan-Wei， ZHOU Xiao-Hong. China Dairy Industry， 1997， 25（3）： 39-41

張?zhí)m威， 周曉紅. 中國乳品工業(yè)， 1997， 25（3）： 39-41

8 Carratu B， Boniglia C， Scalise F， Ambruzzi A M， Sanzini E. Food Chem.， 2003， 81（3）： 357-362

9 Chtourou A， Brignon G， Ribadeau-Dumas B. J. Dairy. Res.， 1985， 52（2）： 239-247

10 Picciano M F. Pediatr. Clin. North Am.， 2001， 48（1）： 263-264

11 HUANG Yu， REN Hao-Wei， LIU Biao， LIU Ning， LI Meng， WANG Dong-Mao. Chinese Journal of Chromatograph， 2013， 31（5）： 429-434

黃 宇， 任皓威， 劉 彪， 劉 寧， 李 萌， 王東茂. 色譜， 2013， 31（5）： 429-434

12 LIU Wei， LI Meng， REN Hao-Wei， LIU Ning. J. Spectroscopy and Spectral Anylysis， 2014， 34（12）： 3281-3287

劉 微， 李 萌， 任皓威， 劉 寧. 光譜與光譜學(xué)分析， 2014， 34（12）： 3281-3287

13 REN Hao-Wei， ZHANG Wan-Shu， LI Xiang-Yi， LIU Ning. Spectroscopy and Spectral Anylysis， 2015， 35（2）： 384-389

任皓威， 張婉舒， 李相怡， 劉 寧. 光譜與光譜學(xué)分析， 2015， 35（2）： 384-389

14 Yasuaki W， Bo L. J. Nutr. Biochem.， 2014， 25（5）： 503-514

15 Apollinaire T， Andrea R， Lyness B， Jean C L， Havard J， James K F. Food Chem.， 2011， 126（3）： 1138-1143

16 Mandal S M， Bharti R， Porto W F， Gauri S S， Mandal M， Franco O L， Ghosh A K. Peptides，2014， 56： 84-93

17 Puri A， Bhattacharya M， Tripathi L M， Haq W. Inter. Immunopharmacol.， 2009， 9（9）： 1092-1096

18 Richard A. P， William W.F， Steven H. A. Fetal and Neonatal Physiology. America： Saunders， 2011： 1241-1243

19 Agunod M， Yamaguchi N， Lopez R， Luhby L， George B， Jerzy G. Am. J. Dig. Dis.， 1969， 14： 400-414

20 Johns P W. Analytical Method for the Determination of Infant Formula Protein Digestibility In vitro： United States， US 7939659B2. 2008-07-01endprint