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        毛細管電泳法在酶抑制劑篩選中的應用

        2015-07-09 18:17:17劉冬梅師彥平陳娟
        分析化學 2015年5期
        關鍵詞:綜述

        劉冬梅 師彥平 陳娟

        摘 要 毛細管電泳法以其分離效率高、耗時短、樣品用量少、靈敏度高以及易于實現(xiàn)自動化等諸多特點,在篩選酶抑制劑研究中有著不可替代的優(yōu)勢。本文綜述了毛細管電泳法在酶抑制劑篩選中的應用。主要介紹了應用最廣泛的離線分析(Off-line assay)和在線分析(In-line assay),即柱前酶反應(Pre-capillary enzyme reaction)和在柱酶分析(In-capillary enzyme reaction)。并對該領域的未來發(fā)展進行了展望。

        關鍵詞 毛細管電泳; 酶抑制劑; 柱前酶反應; 在柱酶反應; 綜述

        1 引 言

        人類疾病的產(chǎn)生往往與體內(nèi)各種酶的異常表達有關,如果酶的活性異常高于正常水平,則會引起機體功能紊亂,引發(fā)疾病的產(chǎn)生。如乙酰膽堿酯酶(AChE)過多,則會過度分解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿,從而引起阿爾茨海默癥(老年癡呆癥)和肌無力【1】; 酪氨酸酶(TRS)是黑色素合成的關鍵酶和限速酶,TRS活性過高則會引起黑色素沉積,引發(fā)皮膚色素性疾病【2】。通過抑制關鍵酶來干預治療已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學很有吸引力的戰(zhàn)略,目前有相當一部分臨床藥物來自酶抑制劑【3】。

        酶抑制劑篩選的傳統(tǒng)途徑有放射性同位素法、薄層色譜法、電化學法、分光光度法和高效液相色譜法等,這些方法雖然已經(jīng)非常成熟,但是仍然存在一些不可避免的缺陷【4】。毛細管電泳法以其分離效率高、耗時短、樣品用量少、易于實現(xiàn)自動化等諸多特點,特別是高效分離機制,在酶抑制劑篩選中顯示出傳統(tǒng)方法無法比擬的優(yōu)勢。而且,毛細管電泳法可以結合多種檢測方法,如紫外、激光誘導熒光、質(zhì)譜、電化學以及輻射檢測【5】等進行目標物的分析,其中,紫外檢測以其成本低、操作方便、環(huán)境友好等優(yōu)勢成為最廣泛使用的檢測方法。

        毛細管電泳-紫外檢測的靈敏度受到待分析物濃度的限制。通過增加檢測光程或樣品濃縮富集可提高檢測靈敏度【6】,例如改變檢測池的幾何形狀,包括泡形池、Z形池和多次反射池來增加檢測光程,以及零電壓效應、樣品堆積、場放大堆積和場放大進樣等濃縮富集技術提高檢測的靈敏度。Iqbal等【7】在監(jiān)測核苷酸焦磷酸酶和磷酸二酯酶的反應時,在內(nèi)壁涂層為聚凝胺陽離子的毛細管內(nèi),將聚凝胺加到緩沖溶液中,利用產(chǎn)物與聚凝胺電遷移方向相反,使得產(chǎn)物堆積來提高檢測靈敏度。也可以通過將樣品溶解在水中,或者采用稀釋的緩沖液使樣品堆積【8】。

        毛細管電泳法篩選酶抑制劑主要有4種形式:柱前酶反應(Pre-capillary enzyme reaction)、毛細管進樣端反應(At-inlet reaction)、電泳中介微分析(EMMA)、層流剖面的橫向擴散(TDLFP)技術, 其中,At-inlet、EMMA和TDLFP都屬于在柱酶反應(In-capillary enzyme reaction)。下面將對這幾種形式進行總結論述。

        2 柱前酶反應

        離線分析(Off-line assay)就是反應物首先在毛細管之外混合,加入底物、酶或輔酶引發(fā)反應,經(jīng)特定時間的孵育之后采取適當?shù)姆椒ㄢ缑复俜磻?,然后將樣品注入毛細管電泳中進行分離檢測,通過測定產(chǎn)物或是底物的峰面積變化來進行酶促反應動力學、抑制動力學的研究以及抑制劑的篩選【9,10】。在柱前酶反應中,毛細管電泳只作為分離系統(tǒng)使用。

        辛志宏等【11】利用毛細管離線分析測定了血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑Captopril的活性,優(yōu)化了反應、分離條件,可以準確、簡便、快速的分析Captopril的抑制活性,并且為進一步篩選血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑提供了篩選模型。栗娜等【12】利用毛細管電泳法測定了雞肝二氫葉酸還原酶的活力,測定已知抑制劑的半數(shù)抑制濃度,與文獻數(shù)值相比較,證明該體系可用于二氫葉酸還原酶抑制劑的篩選。賈蕊等【13】使用柱前酶反應與EMMA進行了二氫葉酸還原酶抑制劑的篩選,比較兩種反應模式所得實驗結果,發(fā)現(xiàn)柱前反應模式檢測靈敏度高,遷移時間和峰面積重現(xiàn)性好,并且易于控制。種蕾等【14】由可口革囊星蟲粗提物中篩選出7種對神經(jīng)氨酸酶有抑制活性的粗提物,實驗中優(yōu)化了反應和分離分析條件,建立的模型可用于復雜體系中抗流感病毒藥物神經(jīng)氨酸酶抑制劑的篩選。Iqbal等【15】使用離線毛細管電泳法篩選和鑒定了腺苷激酶的抑制劑和底物。實驗中底物和產(chǎn)物可以高效分離,使用標準抑制劑進行實驗,與標準放射方法相比,兩者抑制動力學常數(shù)Ki相近,證明了建立的篩選模型的可靠性和準確性。Chen等【16】測定了20S蛋白酶對多肽底物MG132和MG115的實時水解,以及一系列化合物對其抑制效果。37 ℃下混合底物和酶溶液引發(fā)酶促反應,冰浴中浸沒10 min猝滅反應,離心后將上清液注入毛細管內(nèi)進行分離檢測。李冰等【17】使用蛋白-脂質(zhì)體復合物進行柱外篩選單胺氧化酶(MAO)抑制劑,通過加入含EDTA和Na2S2O5的HClO4溶液猝滅反應,與傳統(tǒng)的MAO抑制劑篩選方法相比簡單、快速、節(jié)省酶源、干擾因素少。Bryant等【18】使用此模式研究了乙酰輔酶A羧化酶,實驗中將生物素羧化酶和羧基轉(zhuǎn)移酶加入含有抑制劑的反應混合物中,反應一段時間將混合物注入毛細管中分離。該研究允許同時篩選生物素羧化酶和羧基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑。Iqbal等【19】使用柱前酶反應進行了碳酸酐酶的酶促反應動力學和抑制反應動力學研究。他們將碳酸酐酶和底物4-硝基苯基乙酸酯在37 ℃下孵育10 min,降溫終止反應,隨后將反應混合物注入毛細管內(nèi),施加電壓進行產(chǎn)物4-硝基苯酚的分離檢測。Malina等【20】也使用了柱前酶反應進行磷酸果糖激酶-1的酶促反應動力學和抑制反應動力學研究,使用毛細管電泳進行產(chǎn)物與底物的分離,減少了抑制劑對產(chǎn)物的干擾,從而減少了假陽性,所得半數(shù)抑制濃度與耦合分光光度法相符。

        離線分析中酶促反應和毛細管電泳分離是兩個獨立的體系,因此其條件可以分別優(yōu)化,不會對彼此產(chǎn)生干擾。但該方法存在局限性:第一,酶促反應很快,所以混合物在注入毛細管之前,必須通過加入試劑或者改變反應條件來猝滅反應; 第二,盡管毛細管分離檢測只需要納升級的樣品量,但是引發(fā)反應仍需要大量反應物,造成試劑浪費。在柱酶反應模式的出現(xiàn)彌補了上述不足。endprint

        3 在柱酶反應

        在柱酶反應,毛細管不僅可以用作分離通道,同時也可以用作反應容器,酶可以被固定,或以自由酶存在于溶液中。該模式具有以下優(yōu)點:反應溶液體積只需納升級【21】,與柱前反應相比減少了試劑用量,大大降低了分析成本; 集進樣、混合、反應、分離和檢測于一個封閉的毛細管內(nèi),提高了分析效率; 有利于實現(xiàn)酶分析的自動化和微型化【22】。在柱酶反應可以分為EMMA、At-inlet和TDLFP三類。

        3.1 電泳中介微分析(EMMA)

        為解決柱前酶反應中樣品消耗量大、無法實現(xiàn)自動化等缺陷,Bao和Regnier【23】首次報導了在線電泳酶分析,該模式后來被命名為電泳中介微分析(EMMA)。EMMA是在電場作用下利用反應物在緩沖液中表觀遷移速率的差異來實現(xiàn)反應物在柱內(nèi)混合,從而引發(fā)酶促反應,隨后反應物和產(chǎn)物在毛細管內(nèi)被分離為獨立的區(qū)帶至檢測器被檢測。在該模式中,酶與試劑的混合是在電場作用下的混合,無額外稀釋和區(qū)帶展寬效應。根據(jù)電場下反應物在毛細管內(nèi)進樣和混合模式,EMMA可以分為兩類,即連續(xù)模式和區(qū)帶-區(qū)帶模式。

        3.1.1 連續(xù)模式

        連續(xù)模式是毛細管內(nèi)預先充滿一種反應物,根據(jù)第二種反應物的注射方式可分為兩類:帶狀注射法(圖1A)和移動界面注射法。Bao和Regnier【23】發(fā)展了帶狀注射法,并以葡萄糖-6-磷酸脫氫酶為模型對其進行驗證。毛細管內(nèi)預先充滿含有底物葡萄糖-6-磷酸和輔酶NADH的運行緩沖液,酶溶液獨立存在于一個進樣瓶中,以區(qū)帶模式進樣,反應物在電場作用下混合引發(fā)酶促反應,隨后反應物和產(chǎn)物在毛細管內(nèi)被分離為獨立的區(qū)帶至檢測器被檢測。Harmon等【24】發(fā)展了移動界面注射法,以亮氨酸氨肽酶為模型對其進行驗證。毛細管內(nèi)預先充滿遷移速度小的酶溶液,遷移速度大的底物L-亮氨酸-4-硝基苯胺溶液保存于進樣端的緩沖液儲液瓶中連續(xù)進樣。帶狀注射法中,第二種反應物一旦進樣就不會再有新的反應物進入毛細管內(nèi),而移動界面注射法在整個運行過程中都有新的底物注入毛細管內(nèi),從而增加了底物與酶的接觸時間,增加產(chǎn)物產(chǎn)量,提高檢測靈敏度。

        3.1.2 區(qū)帶-區(qū)帶模式 根據(jù)毛細管內(nèi)孵育緩沖液和背景電解質(zhì)溶液的異同,區(qū)帶-區(qū)帶模式可以分為兩類,即經(jīng)典區(qū)帶-區(qū)帶模式和部分填充模式。

        經(jīng)典區(qū)帶-區(qū)帶模式(圖1B)中反應緩沖液和分離緩沖液為同一種緩沖液,預先在毛細管內(nèi)充滿緩沖液,然后按照表觀遷移速度由小到大的順序?qū)⒎磻镆詤^(qū)帶模式注入毛細管內(nèi)。施加較小的電壓之后,表觀遷移速度大的反應物在毛細管內(nèi)流速快,與表觀遷移速度小的反應物混合重疊,從而引發(fā)酶促反應。可以通過關閉電壓來延長反應時間,從而增加產(chǎn)物量,提高檢測靈敏度。經(jīng)孵育之后,增加電壓分離產(chǎn)物和殘余反應物。

        與連續(xù)模式相比,區(qū)帶-區(qū)帶模式只需要一小段的反應物,反應物用量少,反應成本低,因此區(qū)帶-區(qū)帶模式是EMMA中最常用的。然而,在經(jīng)典區(qū)帶-區(qū)帶模式中,緩沖液既要有利于酶促反應進行,又要有利于產(chǎn)物和反應物的分離,因此仍存在一定的局限性。van Dyck等【25】在研究牛血清胺氧化酶時,發(fā)現(xiàn)酶在背景電解質(zhì)溶液中不能穩(wěn)定存在,因此提出了部分填充模式,即毛細管的一部分填充有利于酶促反應的孵育緩沖液,剩余部分填充背景電解質(zhì)溶液來實現(xiàn)產(chǎn)物和反應物的分離。一般,為了防止背景電解質(zhì)溶液對酶促反應體系產(chǎn)生干擾,則在反應物之前注入一小段孵育緩沖液將酶與背景電解質(zhì)溶液隔開(圖1C)。

        EMMA在篩選中藥提取物中酶抑制劑時具有很大優(yōu)勢。由于α-葡萄糖苷酶的酶促反應體系最適孵育緩沖液為磷酸緩沖液(pH 7.0),而有利于產(chǎn)物和反應物分離的最適分離緩沖液硼砂(pH 9.2)對酶有滅活作用,所以EMMA部分填充技術被應用于α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選【26】。盡管有報導稱電場作用下混合兩種以上的反應物優(yōu)化過程繁瑣而且不切實際【27】,但是,Zhang等【5】在對細胞色素P450進行動力學研究時成功地發(fā)展了在柱電泳混合3個反應物區(qū)帶的方法。Zhao等【28】借鑒此方法由中藥中篩選了芳香化酶抑制劑,毛細管內(nèi)樣品注射順序為輔酶、孵育緩沖液、芳香化酶、抑制劑和底物混合液,施加電壓混合反應物,通過產(chǎn)物的峰面積來確定酶活,以及篩選抑制劑。此外,在對甘油激酶進行動力學研究時,Nehmé等【29】在EMMA部分填充技術的基礎上首次發(fā)展了在線混合至少4個反應物區(qū)帶的方法,反應物的注射順序為:孵育緩沖液、抑制劑、ATP、甘油激酶、甘油,這種方法避免了預先混合底物和抑制劑這一步驟,從而減小了工作量。

        為了提高EMMA的分離速度和靈敏度,Sanders等【30】基于區(qū)帶-區(qū)帶模式提出了快速轉(zhuǎn)換電壓極性的電泳中介微分析,如圖1D所示:順序進樣酶和底物,底物的表觀遷移速度較大,因此兩者混合; 然后反轉(zhuǎn)電極,酶和底物與原來相比反向遷移,因此底物與酶分離; 反轉(zhuǎn)電極,底物與酶再次混合。此模式中,由于兩種反應物的表觀遷移速度的不同,當交替施加正負電壓時,反應物持續(xù)快速混合,進而增加產(chǎn)物產(chǎn)量。

        圖1 在線分離的模式,(A)EMMA連續(xù)模式; (B)經(jīng)典區(qū)帶-區(qū)帶模式; (C)部分填充模式; (D)快速切換電極EMMA; (E)進樣端軸向擴散模;(F)層流剖面的橫向擴散【31】

        4 結 論

        毛細管電泳作為一種高效、快速的分離技術,近年來在酶促反應動力學和抑制動力學研究領域得到廣泛應用并得以快速發(fā)展。離線分析中可以對酶促反應條件和分離條件分別進行優(yōu)化,因此限制因素少。在線分析集進樣、混合、反應、分離和檢測于一體,簡化了操作步驟,縮短了分析時間,與離線分析相比,不僅可以減少試劑消耗,而且可以實現(xiàn)酶反應和檢測的自動化和微型化。毛細管電泳法尤其是在線分析的優(yōu)勢,使其廣泛地應用于酶抑制劑的篩選中。綜上,在線分析的各種模式都具有各自的優(yōu)勢,但仍存在一些不足:如電泳中介微分析中酶不能夠被重復利用,與固定化酶微反應器相比也造成了試劑浪費; 但毛細管在線固定化酶微反應器又不能適用于反應緩沖液和分離緩沖液不同的酶促反應體系,而且各種固定方法也存在各自的缺陷; 層流剖面的橫向擴散優(yōu)化條件繁瑣,而且不能消除由緩沖液造成的稀釋效應。因此,今后的發(fā)展方向是:(1)在現(xiàn)有的技術基礎上,尋找新的材料,設計新的酶固定方法,以此同時實現(xiàn)毛細管的再生利用,提高固定化酶的穩(wěn)定性; (2)設計毛細管電泳篩選酶抑制劑新的在線模式,以彌補上述在線模式的不足之處。隨著毛細管電泳技術的不斷發(fā)展完善,該技術應用于酶抑制劑篩選的研究也會愈加成熟。endprint

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