徐國(guó)發(fā)　鄭仕萍　張建博等

摘要：目的研究和分析單寧酸在不同pH的磷酸鹽緩沖液中水解后的含量變化。方法采用在常溫下觀(guān)察單寧酸在不同pH的磷酸鹽緩沖液（pH分別為2、3、4、5、6）中的水解情況，應(yīng)用反相高效液相色譜儀測(cè)定單寧酸及其水解產(chǎn)物沒(méi)食子酸含量，并比較和分析單寧樣品液水解前后單寧酸和沒(méi)食子酸含量變化。結(jié)果單寧酸隨著pH值的上升，其含量呈逐漸下降的趨勢(shì)，沒(méi)食子酸的含量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。結(jié)論單寧酸及其水解產(chǎn)物沒(méi)食子酸在不同pH條件下的含量變化反映了酸堿度對(duì)單寧酸水解反應(yīng)的影響，本實(shí)驗(yàn)研究可為單寧酸在中藥提取加工、養(yǎng)護(hù)、儲(chǔ)存等方面的應(yīng)用提供一定參考。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)螌幩幔凰夥磻?yīng)；沒(méi)食子酸 pH；磷酸鹽緩沖液

中圖分類(lèi)號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2015）06-0088-03

單寧酸（Tannic acid）是一種存在于多種天然藥用植物的多元酚類(lèi)化合物，具有很強(qiáng)的生物和藥理活性，是具有重要開(kāi)發(fā)價(jià)值的天然產(chǎn)物[1]。分子式C76H52O46，能溶于乙醇、水、丙酮，幾乎不溶于苯、乙醚、石油醚、氯仿等[2]。，是沒(méi)食子酸酯及其衍生物與葡萄糖或多酚通過(guò)酯鍵相連形成的化合物，遇酸、堿、酶能夠水解，水解時(shí)能生成雙沒(méi)食子酸酯，雙沒(méi)食子酸酯能進(jìn)一步水解成沒(méi)食子酸和葡萄糖等小分子化合物[3-5]。單寧酸存在于多種植物的樹(shù)皮和果實(shí)中，如中國(guó)五棓子、塔拉果莢、石堅(jiān)石榴、漆樹(shù)葉、黃護(hù)、金縷梅樹(shù)、柿子、君遷子、葡萄、李子、梨、山核桃、橘子、桃子、山楂、茶葉等。單寧酸在醫(yī)學(xué)上能用于收斂、止血、抗菌消炎、止瀉、驅(qū)蟲(chóng)、抗多種病原體感染，對(duì)化學(xué)誘變的皮膚、肺、前胃腫瘤有很好的抑制作用，能與細(xì)胞外或組織外的鈣離子絡(luò)合.可抵抗平滑肌鈣誘導(dǎo)的收縮，發(fā)揮降血壓作用[6]，能夠阻礙鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的誘導(dǎo)和過(guò)氧化物的產(chǎn)生，提高老鼠體內(nèi)的抗氧化和抗癌效果[7]，對(duì)HIV-RT有一定抑制活性[8]，還具有抗突變、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、改善肝腎功能、降脂等作用[9]。食品領(lǐng)域中能作酒類(lèi)和飲料的澄清劑、穩(wěn)定劑以及食品添加劑中的輔色、調(diào)味、賦形等[10-12]，此外單寧酸在制革、日化、冶金、染料、電子及輕工等領(lǐng)域中也應(yīng)用廣泛。

沒(méi)食子酸（Gallic acid）也是一種多酚類(lèi)弱酸性化合物。化學(xué)式為C7H6O5，化學(xué)命名為 3，4，5-三羥基苯甲酸[13]。通常以糖苷鍵或酯鍵的形式與多元醇結(jié)合成水解單寧存在于植物體和果實(shí)中，能溶于熱水、乙醇、乙醚、甘油和丙酮，難溶于冷水，不溶于苯和氯仿。在堿性和中性條件下較不穩(wěn)定，而對(duì)強(qiáng)酸（1mol/L）、強(qiáng)光、高溫較穩(wěn)定，在pH為2～6的磷酸鹽緩沖液條件下能保持相對(duì)穩(wěn)定[14]。沒(méi)食子酸對(duì)肝臟、腎臟、心血管有較強(qiáng)的親和力，具有抗突變、抗炎、抗氧化、抑菌、降血糖、心血管保護(hù)等生物學(xué)效應(yīng)，其中對(duì)腫瘤、多種致癌、促癌物有突出的抵抗作用[15-20]。

單寧酸和沒(méi)食子酸作為一種在醫(yī)藥等領(lǐng)域都具有重要作用的多酚類(lèi)鞣質(zhì)，為合理地利用單寧酸等多酚類(lèi)鞣質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)單寧酸的化學(xué)性質(zhì)及沒(méi)食子酸的穩(wěn)定性，觀(guān)察單寧酸在不同pH緩沖溶液中水解后含量及其產(chǎn)物沒(méi)食子酸的含量變化情況。

1實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1實(shí)驗(yàn)藥品單寧酸樣品（購(gòu)自成都邁斯克公司）；單寧酸對(duì)照品（購(gòu)自云南省藥檢所）；沒(méi)食子酸對(duì)照品（購(gòu)于昆明中檢所）；

1.2儀器與試劑Agilent1200型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；分析天平；電子天平；精密pH測(cè)定儀計(jì)（0.01pH）；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋；移液管；燒杯；玻璃棒；容量瓶；0.45um微孔濾膜；1mL注射器；甲醇（色譜純）；磷酸（分析純）；磷酸氫二鈉（分析純）；丙酮（分析純）；純化水；

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1磷酸鹽緩沖液的配制A液：取磷酸16.6 mL，加純化水至1000 mL，搖勻。B液：稱(chēng)取磷酸氫二鈉71.63 g，加純化水使溶解成1000 mL。取上述A液72.5 mL與B液27.5 mL混合配制，搖勻，即得pH=2.00的緩沖液。以pH=2的緩沖液為基本底液，再用純化水將其稀釋成pH為2、3、4、5、6的緩沖液。

2.2對(duì)照品溶液的制備取沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，于分析天平上精密稱(chēng)定，加50%甲醇溶解配制定容成每1 mL含25 μg的溶液，即得；取單寧酸對(duì)照品適量，于分析天平上精密稱(chēng)定，用乙醇：水：丙酮（69.9%：29.8%：0.3%）溶解定容成每1 mL含30 μg的溶液，即得。

2.3供試品溶液的制備取單寧酸樣品適量，精密稱(chēng)定樣品0.00500 g，以乙醇：水：丙酮（69.9%：29.8%：0.3%）溶解，配制定容成每1 mL含20 μg的溶液25 mL。取移液管分別吸取制備好的單寧酸樣品溶液1 mL，放入固定體積的不同pH的磷酸鹽緩沖液中，超聲使其溶解和混勻，以恒溫水浴鍋控制水浴環(huán)境溫度在25±0.5℃，讓單寧酸樣品溶液在恒溫條件下充分水解1 h，對(duì)水解后的樣品液用微孔濾膜（0.45 um）進(jìn)行過(guò)濾后，即得供試品溶液。

2.4色譜條件

2.4.1單寧酸色譜條件色譜柱ZoRBAX SB-C18柱（4.6×250 mm，5 um）；流動(dòng)相：甲醇-水（80：20）；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：2 uL[21]。

2.4.2沒(méi)食子酸色譜條件色譜柱ZoRBAX SB-C18柱（4.6×250 mm，5 um）；流動(dòng)相：甲醇和0.2%磷酸（5：95）；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：273 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 uL。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

2.5.1單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制于分析天平上精密稱(chēng)定定量的單寧酸對(duì)照品，以乙醇：水：丙酮（69.9%：29.8%：0.3%）溶解定容配制成每1 mL含31μg的溶液，按上述單寧酸色譜條件分別取1、3、5、7、9ul不同體積進(jìn)樣，以單寧酸的峰面積（Y）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量（X）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程Y=5261.5X-24.993，R2=0.9987，結(jié)果表明：?jiǎn)螌幩岱迕娣e值與質(zhì)量有良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性范圍為0.132-0.396 ug。

2.5.2沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制取沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，于分析天平上精密稱(chēng)定，加50%甲醇溶解配制定容成每1 mL含33μg的溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣4、6、8、10、12 μL，以沒(méi)食子酸的峰面積（Y）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（X）進(jìn)線(xiàn)性回歸，得方程Y=1740.2x-68.001，R2=0.9964，結(jié)果表明：沒(méi)食子酸峰面積值與質(zhì)量有良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性范圍為0.062-0.31 ug。

2.6單寧酸和沒(méi)食子酸的含量測(cè)定分別取2.3項(xiàng)下方法制備的供試品溶液，按2.4色譜條件分別測(cè)定單寧酸、沒(méi)食子酸在不同pH的磷酸鹽緩沖液條件下的含量，用外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1從圖中可以看出，在pH2～6的范圍內(nèi)，隨著pH值的增大，單寧酸含量逐漸減少（見(jiàn)圖3），沒(méi)食子酸含量逐漸增加（見(jiàn)圖4）。據(jù)此表明單寧在接近中性環(huán)境中更易水解產(chǎn)生沒(méi)食子酸。

3.2從表1中的數(shù)據(jù)中可以看出，當(dāng)pH 2～4的范圍內(nèi)，單寧酸含量下降速度快，pH 5～6時(shí)單寧酸含量下降速度慢，而沒(méi)食子酸含量在pH 2～4范圍內(nèi)上升慢，在pH 5～6時(shí)含量上升快，說(shuō)明在pH 2～4范圍極大部分的單寧并未轉(zhuǎn)化為沒(méi)食子酸，其有可能產(chǎn)生1，2，3，4，6-五-O-沒(méi)食子酰-β-D-葡萄糖（β-PGG）、雙沒(méi)食子酸酯、雙沒(méi)食子酸等其它的多酚化合物。說(shuō)明pH2～4在不利于單寧酸酯鍵斷裂產(chǎn)生沒(méi)食子酸。

3.3通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析單寧酸和沒(méi)食子酸的含量變化，可以初步認(rèn)為在溫和的pH條件下更有利于單寧的酯鍵或苷鍵斷裂產(chǎn)生沒(méi)食子酸。

4結(jié)論

單寧酸和沒(méi)食子酸存在于多種藥用植物中，具有很強(qiáng)的藥學(xué)活性，在醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣闊開(kāi)發(fā)利用的前景。通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定和分析單寧酸及其產(chǎn)物沒(méi)食子酸在不同pH條件下的含量變化情況，讓我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)了單寧酸和沒(méi)食子酸的化學(xué)穩(wěn)定性，此實(shí)驗(yàn)可為進(jìn)一步了解和研究單寧酸及多酚化合物理化性質(zhì)提供一定參考，也為醫(yī)藥及相關(guān)領(lǐng)域?qū)螌幩岬暮侠砝锰峁┮欢ǖ膮⒖肌?/p>

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（收稿日期：2015-03-23）