楊 波，曹 萌，齊靜嫻，李 嬌，朱廣俠，張冠軍，王一理

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院癌癥研究所，陜西 西安710061；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院腫瘤研究中心，陜西 西安710061；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安710061)

陜西地區(qū)宮頸癌和細(xì)胞學(xué)正常婦女HR-HPV病毒流行譜分析

楊 波1，2，曹 萌1，2，齊靜嫻1，2，李 嬌3，朱廣俠3，張冠軍2，王一理1，2

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院癌癥研究所，陜西 西安710061；
2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院腫瘤研究中心，陜西 西安710061；
3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安710061)

目的 分析陜西地區(qū)高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)陽性，但宮頸細(xì)胞學(xué)正常和宮頸癌患者HPV病毒譜。方法 利用PCR基因擴(kuò)增方法，檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞中8種HR-HPV DNA(包括HPV16、18、31、33、35、45、52、58等)并行細(xì)胞病理學(xué)檢測(cè)。對(duì)1 005例HR-HPV陽性但宮頸細(xì)胞學(xué)正常標(biāo)本及160例經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)宮頸癌標(biāo)本進(jìn)行HPV感染譜對(duì)比分析。結(jié)果 正常細(xì)胞學(xué)組與宮頸癌組的HR-HPV型別分布除HPV35、45外，其余型別HPV16、18、31、33、52、58等差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為465.147、110.288、9.261、4.496、30.155、46.559，均P<0.05)；正常細(xì)胞學(xué)組中HPV多為單一感染，而宮頸癌組中多重HPV感染較為常見。單一感染均以HPV16最為常見，在正常細(xì)胞學(xué)組和宮頸癌組分別占34.9%和37.6%。雙重感染在正常細(xì)胞學(xué)組以HPV16合并HPV52最為常見(占2.9%)；而宮頸癌組則以HPV16合并HPV18最為常見(占20.8%)。結(jié)論 正常細(xì)胞學(xué)組HPV感染譜與宮頸癌組中相同HPV型別分布的差異均有助于理解HPV致癌機(jī)理以及預(yù)防性HPV疫苗的設(shè)計(jì)。

正常細(xì)胞學(xué)；子宮頸癌；HPV基因型；陜西地區(qū)

高危型人乳頭瘤病毒(high risk human popillomavirus，HR-HPV)感染是宮頸癌(ICC)的始動(dòng)因素已經(jīng)成為共識(shí)，宮頸癌在世界范圍內(nèi)是僅次于乳腺癌的婦女第2位惡性腫瘤。在有些發(fā)展中國家，宮頸癌甚至是育齡婦女的主要死因[1]?；贖R-HPV感染與宮頸癌的關(guān)系，HR-HPV檢測(cè)結(jié)合宮頸脫落細(xì)胞學(xué)已經(jīng)成為常規(guī)的宮頸癌篩查手段，特別是對(duì)HR-HPV感染患者，應(yīng)作為重點(diǎn)追蹤觀察的對(duì)象。這一策略已經(jīng)取得了肯定的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[2]。已知絕大多數(shù)人乳頭瘤病毒(HPV)感染可自行消退，僅持續(xù)性感染的HR-HPV可能引發(fā)腫瘤，比較不同級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)與宮頸癌時(shí)HR-HPV感染譜的變化已有較多報(bào)道，當(dāng)形成高級(jí)別CIN至宮頸癌，HR-HPV感染譜的變化較為接近[3-4]，在全球范圍內(nèi)，HPV16作為最流行的HR-HPV型別，無論是在宮頸細(xì)胞學(xué)正常人群或不同級(jí)別CIN直至浸潤性宮頸癌，感染頻數(shù)居最高，但其他HR-HPV在不同人群不同疾病狀態(tài)則變化較大[5-7]。比較分析宮頸細(xì)胞學(xué)正常但HR-HPV陽性病毒譜與宮頸癌組織中HR-HPV病毒譜的差異和變化，有助于了解HR-HPV致癌機(jī)理以及預(yù)防性疫苗的設(shè)計(jì)。陜西地區(qū)曾是宮頸癌高發(fā)區(qū)，本研究分析了陜西地區(qū)HR-HPV在正常的宮頸脫落細(xì)胞學(xué)和宮頸癌標(biāo)本中的狀況，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本取自2012年1月至2013年12月西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診籍貫為陜西地區(qū)婦女，樣本分為兩份，一份利用液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)(TCT)制片、巴氏染色，細(xì)胞病理學(xué)觀察；另一份保存于4℃，24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行HPV DNA檢測(cè)。根據(jù)基因檢測(cè)、細(xì)胞病理學(xué)結(jié)果，收集細(xì)胞學(xué)正常但HR-HPV陽性標(biāo)本共計(jì)1 005例作為正常細(xì)胞學(xué)組。宮頸癌組是來自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科經(jīng)切片證實(shí)的160例進(jìn)展期的人宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織活檢標(biāo)本。

1.2 人乳頭瘤病毒基因檢測(cè)

1.2.1 正常細(xì)胞學(xué)組人乳頭瘤病毒基因檢測(cè)

采用凱普HPV分型診斷系統(tǒng)(潮州)進(jìn)行宮頸脫落細(xì)胞HPV基因分型，實(shí)驗(yàn)過程根據(jù)操作指南進(jìn)行。

1.2.2 宮頸癌組人乳頭瘤病毒基因檢測(cè)

1.2.2.1 提取組織 每例樣本收集約25～100mg石蠟切片組織按照試劑盒操作說明提取宮頸癌組織基因組DNA(DP304 北京天根公司)，溶于TE緩沖液中待用。

1.2.2.2 人乳頭瘤病毒檢測(cè)型特異性引物設(shè)計(jì) 本研究采用E6作為擴(kuò)增的靶基因，以β-globin 作為內(nèi)參照以檢測(cè)DNA的完整性。HPV共有引物(GP5+/GP6+)和型特異性引物(E6)用于檢測(cè)8種HR-HPV(16、18、31、33、35、45、52、58)的分型。引物設(shè)計(jì)利用primer3軟件參照National Center for Biotechnology Information(NCBI) website http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.提供的堿基序列完成，引物合成由奧康生物技術(shù)公司完成，見表1。

1.2.2.3 PCR擴(kuò)增特定人乳頭瘤病毒基因片段 參照試劑盒說明常規(guī)進(jìn)行宮頸癌組織HPV基因PCR擴(kuò)增。PCR預(yù)混溶液(PCRMaster Mix，北京天根)25μL加入模板DNA2μL，反應(yīng)條件如下：起始變性(95℃，5分鐘)，變性(94℃，30秒)，退火30秒，延伸(72℃，30秒)共35個(gè)循環(huán)。取擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳后EB染色進(jìn)行觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 HPV分型的引物序列

2 結(jié)果

2.1 高危人乳頭瘤病毒型別在正常細(xì)胞學(xué)和宮頸癌組織中的分布

正常細(xì)胞學(xué)組HR-HPV型別分布依次為HPV16(43.4%)、HPV52(25.7%)、HPV58(19.9%)、HPV18(9.8%)、HPV31(8.4%)、HPV33(7.7%)、HPV45(1.5%)、HPV35(1.2%)；將宮頸癌組的160例標(biāo)本中的149例β-globin陽性標(biāo)本納入本研究，其中19例β-globin陽性標(biāo)本未檢測(cè)出HPV DNA，認(rèn)為HPV陰性，HR-HPV檢出率為87.2%。宮頸癌組HR-HPV型別分布則依次為HPV16(73.2%)、HPV18(41.6%)、HPV58(11.4%)、HPV52(5.4%)、HPV33(2.7%)、HPV45(2.0%)、HPV31%(1.3%)、HPV35(0)。兩組相比，除HPV35、45外，其余HR-HPV型別差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表2。

雖然HPV52頻數(shù)在正常細(xì)胞學(xué)組高達(dá)25.7%，但在宮頸癌組則降低至5.4%；HPV18從9.8%升至41.6%；HPV58雖在宮頸癌組有所降低，但降低的幅度遠(yuǎn)低于HPV52。

表2 8種常見HR-HPV基因型在正常細(xì)胞學(xué)組和宮頸癌組分布比較[n(%)]

Table 2 Distribution of 8 common HR-HPV genotypes in normal cytology group and cervical cancer group[n(%)]

2.2 高危人乳頭瘤病毒型別感染在正常細(xì)胞學(xué)和宮頸癌組織中的狀態(tài)

本研究結(jié)果顯示正常細(xì)胞學(xué)組單一感染較為常見，HPV31、33、52、58均高于宮頸癌組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；但多重感染在宮頸癌組明顯高于正常細(xì)胞學(xué)組，兩組中各型HR-HPV頻數(shù)及感染狀態(tài)見表3。

表3 正常細(xì)胞學(xué)組和宮頸癌組中各型HR-HPV頻數(shù)及感染狀態(tài)[n(%)]

Table 3 Frequency and infection status of HR-HPV types in normal cytology group and cervical cancer group[n(%)]

(轉(zhuǎn)下表)

(續(xù)上表)

HR-HPV組合正常細(xì)胞學(xué)組(n=1005)宮頸癌組(n=149)χ2PHPV16,5229(2.9)3(2.0)0.3660.787HPV16,5815(1.5)4(2.7)0.6400.709HPV18,5212(1.2)1(0.7)0.3191.000HPV18,583(0.3)3(2.0)7.3780.031HPV16,18,5202(1.3)13.3340.017HPV16,18,5809(6.0)61.1870.000HPV16,52,583(0.3)00.4461.000HPV18,52,581(0.1)00.1481.000主要HR-HPV多重感染(合計(jì))73(7.3)53(35.6)106.8990.000其它HR-HPV多重感染(合計(jì))79(7.9)6(4.0)2.7950.095多重HR-HPV感染(總計(jì))152(15.1)59(39.6)52.0160.000

3 討論

臨床上HPV篩查重要的是HR-HPV，其他型別因與宮頸癌無關(guān)而不用于宮頸癌篩查，低危HPV型別檢測(cè)對(duì)宮頸癌篩查和異常細(xì)胞學(xué)婦女的評(píng)估沒有臨床意義。HR-HPV DNA結(jié)合宮頸細(xì)胞學(xué)檢測(cè)已成為公認(rèn)的常規(guī)宮頸癌篩查策略，而HR-HPV DNA檢測(cè)在確定患者包括隨訪間隔等臨床處理方式中起決定性作用[2]。目前推薦，在有條件的地區(qū)進(jìn)行宮頸細(xì)胞學(xué)與HPV雙篩查，30歲以上的婦女普查，兩種檢查均陰性，每3年復(fù)查1次，若HPV陽性，則每年復(fù)查1次。

3.1 各型高危人乳頭瘤病毒在兩組中分布頻數(shù)不同

已有報(bào)道，HR-HPV在輕度CINⅠ和浸潤性宮頸癌中頻數(shù)不同[3]，即便是中度CINⅡ、重度CINⅢ和宮頸癌之間，HR-HPV譜也表現(xiàn)不同。如歐洲篩查結(jié)果顯示，CINⅢ最常見的HR-HPV型別是HPV16/33/31(59.9/10.5/9.0%)，而宮頸癌最常見的HR-HPV型別則為HPV16/18/45(63.3/15.2/5.3%)[4]。本研究選擇了宮頸細(xì)胞學(xué)正常而HR-HPV型別陽性標(biāo)本，對(duì)照宮頸癌標(biāo)本中HR-HPV型別差異，結(jié)果顯示，HPV16感染在兩組標(biāo)本中均列為第1，但其他型別差異較大，HR-HPV型別譜在不同人群、不同病變類型中的差異現(xiàn)象與以往的報(bào)道相似[7]。值得注意的是，HPV16以外的其他HR-HPV在兩類人群中變化的差異不同。本研究結(jié)果顯示，HPV18從9.8%升高至41.6%，HPV58從19.9%降至11.4%，HPV52在正常細(xì)胞人群中高居第2，比例高達(dá)25.7%，但在宮頸癌組則降低至5.4%。英國的資料顯示，HPV18、33、45、58型在宮頸癌略有下降，HPV52在宮頸癌略有升高，而HPV31則明顯升高[3]。

3.2 高危人乳頭瘤病毒在兩組中的感染狀態(tài)差異

當(dāng)考慮HR-HPV感染狀態(tài)(即單一感染擬或多重感染)在兩組中的分布，可以看出二者明顯的區(qū)別，除了單一HPV16、18感染在宮頸正常細(xì)胞學(xué)組低于宮頸癌組，而其他HR-HPV型別單一感染頻數(shù)均明顯高于宮頸癌組，HPV52、58單一感染幾乎未見于宮頸癌組。但在宮頸癌組，多重感染則明顯多于宮頸正常細(xì)胞學(xué)組。多重感染主要是HPV16、18與其他HR-HPV型別的組合，HR-HPV型別在正常或低級(jí)別細(xì)胞病變和浸潤性宮頸癌組織中頻數(shù)的變化，與以往的報(bào)道類似[8]，這一結(jié)果不但說明HPV16、18是關(guān)鍵的高危型別，而且提示其他被認(rèn)定的高危型別在致癌過程中的獨(dú)立性需要進(jìn)一步探討。特別是中國人群中HPV52在宮頸細(xì)胞正常組感染頻數(shù)很高而受到重視，但在浸潤性宮頸癌時(shí)頻數(shù)很低卻很少強(qiáng)調(diào)，其實(shí)這種變化提示其較低的致癌潛能。

綜上所述，HR-HPV在宮頸細(xì)胞學(xué)正常和浸潤性宮頸癌的頻數(shù)分布的變化以及感染的狀態(tài)，一定程度上反映了HR-HPV在宮頸癌發(fā)生中的作用，充分了解這種變化，有助于理解HPV致癌機(jī)理以及預(yù)防性HPV疫苗設(shè)計(jì)。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：李 旭]

更 正

本刊發(fā)表于2014年第25卷第6期第954～957頁《孕期體操運(yùn)動(dòng)對(duì)不良癥狀改善的效果》一文中通訊作者缺如，現(xiàn)補(bǔ)充更正為：首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院楊興華教授。

High risk human papillomavirus prevalence in women with normal cytology and with cervical cancer in Shaanxi area

YANG Bo1,2, CAO Meng1,2, QI Jing-xian1,2, LI Jiao3, ZHU Guang-xia3, ZHANG Guan-jun2, WANG Yi-li1,2

(1.InstituteforCancerResearchofSchoolofBasicMedicalScience,HealthScienceCenterofXi’anJiaotongUnivertsity,
ShaanxiXi’an710061,China; 2.CenterofCancerResearchoftheFirstAffiliatedHospital,
HealthScienceCenterofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China;
3.DepartmentofGynecologyandObstetrics,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China)

Objective To analyze the spectrum of HPV in women with normal cytology and cervical cancer with high risk human papillomavirus (HR-HPV) in Shaanxi area. Methods HPV16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, 58 DNA in cervical exfoliated cells were detected by PCR. Pap tests were performed for cytopathological analysis. Infection spectrum was analyzed and compared between 1 005 cases with positive HR-HPV and normal cytology and 160 cases of cervical cancer. Results The distribution of HPV16, 18, 31, 33, 52 and 58 was significantly different between normal cytology group and cervical cancer group except for HPV35 and 45 (χ2 value was 465.147, 110.288, 9.261, 4.496, 30.155 and 46.559, respectively, allP<0.05). Infection with single HPV type was more common in the normal cytology group, while infection with multiple HPV types were frequently found in the cervical cancer group. HPV16 was the most prevalent genotype detected in two groups, and the infection rate of it was 34.9% and 37.6% respectively in the normal cytology group and cervical cancer group. Considering multiple infection, HPV16 and 52 were more frequently found in the normal cytology group (2.9%), while in the cervical cancer group the most prevalent multiple infection pattern were HPV16 and 18 (20.8%). Conclusion The difference in the distribution of HPV types found both in normal cytology group and cervical cancer group is helpful for understanding HPV carcinogenic mechanism and designing of prophylactic vaccine.

normal cytology；cervical cancer；human papillomavirus genotype；Shaanxi area

教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(No.20070698097)

楊 波(1983-)，女，在讀碩士，主要從事腫瘤免疫方面的研究。

王一理，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.02.023

R711.74

A

1673-5293(2015)02-0237-03

[投稿日期]2015-01-19