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        一起牦牛巴氏桿菌病的診斷

        2015-06-25 12:12:32王繼練張煥容郝一妹
        動物醫(yī)學進展 2015年8期
        關鍵詞:殺性氏桿菌瓊脂

        王繼練,張煥容,郝一妹

        (1.西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都610041)

        牦牛巴氏桿菌病(Pasteurellosis)是由多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)引起的牛的一種急性敗血性傳染病,又稱牛出血性敗血癥。以肺炎、急性胃腸炎及內(nèi)臟器官廣泛出血等為主要特征[1],臨床表現(xiàn)為高度呼吸困難和體溫升高、氣喘、鼻腔流出漿液性泡沫樣滲出物[2],慢性經(jīng)過表現(xiàn)為皮下組織、關節(jié)、各臟器的局限性化膿性炎癥,急性胃腸炎[3-4]。該病多呈散發(fā)性或地方流行[5],主要發(fā)生在牦牛飼養(yǎng)集中的高寒缺氧地區(qū),一年四季均可發(fā)生,但秋冬季節(jié)發(fā)病較多[6]。中國是牦牛的主產(chǎn)國,據(jù)統(tǒng)計我國牦牛數(shù)量占世界牦??倲?shù)1 400萬頭的92%,分布于青海有470萬頭,西藏415萬頭,四川397.1萬頭,甘肅112萬頭,新疆25萬頭,云南5萬頭左右。我國近年來常有牦牛巴氏桿菌病的相關報道。1990年-2005年青海省有34個縣(市)報道牦牛發(fā)生牛巴氏桿菌病的發(fā)生,占全省行政區(qū)劃縣數(shù)的77.3%,發(fā)生疫情467起,發(fā)病牛29 032頭,死亡牛9 453頭[7]。2004年-2008年5年間,牦牛巴氏桿菌病在青海省天峻縣6個鄉(xiāng)鎮(zhèn)均有發(fā)生,占全縣行政規(guī)劃鄉(xiāng)鎮(zhèn)數(shù)的60%,共發(fā)生疫情10起,疫點共10個,發(fā)病率5.9%(87/1 466),平均致死率為57.47%(50/87)[8]。2010年-2012年,調(diào)查組在甘肅南部牧區(qū)設定了8個調(diào)查點,共計對8 100余頭牦牛進行了巴氏桿菌發(fā)病流行病學情況調(diào)查,牦牛巴氏桿菌病在甘南牧區(qū)平均發(fā)病率達6.87%,病死率達28.7%[9]。巴氏桿菌病給牦牛養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[10]。

        本文對2014年11月初四川甘孜州某牦牛養(yǎng)殖場發(fā)病牦牛進行臨床診斷、病理剖檢變化、細菌的分離純化和染色鏡檢,PCR鑒定及致病性試驗,最終確診該牦牛養(yǎng)殖場發(fā)生的疫病為多殺性巴氏桿菌引起的牦牛巴氏桿菌病,為該病防控提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 主要試劑 普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為杭州微生物公司產(chǎn)品;胎牛血清為GIBCO公司產(chǎn)品;10×buffer、Mg2+、dNTP、ExTaqDNA 聚合酶為TaKaRa公司產(chǎn)品;DNA MarkerⅠ、DH5α大腸埃希菌為 Tiangen公司產(chǎn)品;E.Z.N.ATMGel Extraction Kit(D2501-01)和 E.Z.N.ATMPlasmid MiniKit(D6942-01)為美國Omega生物技術公司產(chǎn)品;pMD19-T序列載體試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

        1.1.2 實驗動物 18g~22g健康昆明小鼠10只,由成都中醫(yī)藥大學提供。

        1.1.3 引物 參照文獻[11]設計多殺性巴氏桿菌的上、下游引物Pm KmT1和Pm KmT2,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成(表1)。

        表1 多殺性巴氏桿菌檢測引物Table 1 Primers for detection of Pasteurella multcida

        1.2 方法

        1.2.1 樣品的采集 病料來自于四川省甘孜州某牦牛養(yǎng)殖場病死牦牛,無菌采取心、肝、脾、肺和淋巴結等樣本。

        1.2.2 臨床癥狀及剖檢病變 發(fā)病牦牛體溫升高,食欲減退,精神委靡,呼吸困難,發(fā)病后期糞便中帶有血液。剖檢發(fā)病牦牛發(fā)現(xiàn)呈急性敗血癥變化,肺臟和脾臟腫大,內(nèi)臟器官廣泛出血,淋巴結腫大,肺泡內(nèi)有大量帶血泡沫,胸腔有滲出液。

        1.2.3 細菌的分離培養(yǎng)及染色鑒定 無菌采取病死牦牛心、肝、脾、肺、腎、腸系膜淋巴結等組織材料劃線接種于含50mL/L胎牛血清的胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)平板上,將每個組織器官分離到的菌落分別接種到普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、血液瓊脂平板和含50mL/L胎牛血清的TSA平板上,37℃培養(yǎng)24h~48h,觀察各組織分離細菌的生長狀況,并進行革蘭染色鏡檢,無菌采取的組織觸片后瑞氏染色并鏡檢觀察。

        1.2.4 動物致病性試驗 將分離細菌培養(yǎng)菌液接種5只昆明小鼠,每只小鼠頸部皮下注射0.2mL菌液,注射后觀察小鼠精神狀態(tài)及發(fā)病死亡情況。同時對5只小鼠腹腔注射生理鹽水(每只0.2mL)作為對照[12]。對死亡或瀕死小鼠處死后無菌采取小鼠心血、肝、脾等組織,劃線接種于含50mL/L胎牛血清的TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h~48h后革蘭染色鏡檢觀察,同時對心血涂片、肝和脾組織觸片進行瑞氏染色觀察。

        1.2.5 分離細菌的PCR鑒定 以各組織器官分離純化的菌落作為模板,通過PCR擴增目的片段。PCR反應體系25μL:10×PCR buffer 2.5μL,4×dNTPs(10mmol/L)2μL,上游引物1μL,下游引物1μL,TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL,模板2μL,無菌水 18.3μL。PCR 反應條件:94 ℃5min;94℃30s,60℃35s,72℃40s,共30個循環(huán);72℃8min。PCR擴增所得產(chǎn)物用20g/L瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結果。

        1.2.6 PCR擴增產(chǎn)物的克隆和測序 采用E.Z.N.ATMGel Extraction Kit(D2501-01)回收PCR產(chǎn)物。按說明書的操作步驟,將回收的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細胞,預培養(yǎng)1.5h后,將預培養(yǎng)液涂布于含有100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24h后挑取陽性菌落接種至含有100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液,送往上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

        2 結果

        2.1 流行病學調(diào)查、臨床癥狀及剖檢病變

        發(fā)病牦牛體溫升高,采食量下降,精神沉郁,呼吸嚴重困難,發(fā)病后期糞便帶血。剖檢死亡牦牛見急性敗血性變化,肺臟和脾臟腫大,內(nèi)臟器官廣泛出血,淋巴結腫大,肺泡內(nèi)有大量血性泡沫,胸腔有滲出液。根據(jù)臨床癥狀與牦牛巴氏桿菌病的臨床特征相符,初步懷疑該病是由多殺性巴氏桿菌引起的牦牛巴氏桿菌病。

        2.2 細菌分離培養(yǎng)

        病死牦牛心、肝、脾、肺、腎、腸系膜淋巴結等組織劃線接種培養(yǎng),最后分離得到多株菌落形態(tài)相同的細菌,根據(jù)巴氏桿菌在不同培養(yǎng)基上的生長狀況不同,選擇普通培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、血清TSA培養(yǎng)基對其進行鑒定。結果在普通培養(yǎng)基上生長貧瘠,麥康凱培養(yǎng)基上不生長,血清TSA培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基上生長良好,菌落灰白色、圓形、濕潤、呈閃光露珠樣菌落,血瓊脂培養(yǎng)未見溶血現(xiàn)象。

        單菌落革蘭染色鏡檢見革蘭陰性短小桿菌,瑞氏染色呈兩極著色的桿菌(圖1、圖2),符合巴氏桿菌的染色特性。

        圖1 革蘭染色Fig.1 Gram staining

        圖2 瑞氏染色Fig.2 Wright’s staining

        2.3 致病性試驗結果

        試驗組小鼠于注射細菌后24h內(nèi)全部死亡。剖檢可見心包和胸腔有漿液性、纖維素性滲出物,腸道出血明顯,肝臟表面有針尖大的灰白色壞死灶。剖檢死亡小鼠,心血涂片、肝和脾組織觸片瑞氏染色鏡檢,可見兩極濃染的小桿菌。

        2.4 PCR鑒定結果

        以分離菌作為模板,經(jīng)PCR擴增,獲得460bp的特異性條帶(圖3),與預期片段大小一致。

        圖3 PCR產(chǎn)物電泳擴增圖Fig.3 Electrophoresis of PCR products of target gene

        分離菌PCR產(chǎn)物克隆測序結果見圖4。在NCBI上對測序結果進行比對分析,結果顯示所獲得的序列與已公布的多殺性巴氏桿菌的KMT1基因部分序列的同源性均大于97%。結果表明分離到的菌株為多殺性巴氏桿菌。

        圖4 NCBI比對結果Fig.4 NCBI comparison results

        3 討論

        本試驗根據(jù)發(fā)病牦牛的臨床癥狀和病理剖檢病變、細菌分離培養(yǎng)特征和染色鑒定結果,以及分離菌對小鼠致病性和多殺性巴氏桿菌PCR檢測結果,確診該致病菌為多殺性巴氏桿菌。該牦牛養(yǎng)殖場暴發(fā)的疾病為牦牛巴氏桿菌病。

        多殺性巴氏桿菌為條件性致病菌,一般存在于健康動物的呼吸道,當家畜在外界誘因諸如氣溫驟變、畜體營養(yǎng)不良、過度疲勞、擁擠、悶熱、長途運輸?shù)拳h(huán)境應激作用下,均可使機體抵抗力下降而發(fā)病[13]。該牦牛場發(fā)病時正是剛從夏季牧場轉(zhuǎn)運至冬季牧場,且由于冬季牧場旁噪聲巨大的礦石加工廠,牦牛轉(zhuǎn)運和環(huán)境條件的應激與該病的條件誘發(fā)性發(fā)生相符。因此,建議飼養(yǎng)過程中應減少導致該病發(fā)生的多種應激因素[14],平時應加強飼養(yǎng)管理,提高飼養(yǎng)營養(yǎng)水平,增強牦牛體質(zhì),做好平時的預防消毒工作,牧區(qū)放牧牦牛應注意避開過渡陰濕草場放牧[15]。

        對于發(fā)病區(qū)域應嚴格進行場地的消毒,具體方法可將患畜排瀉物堆積后用生石灰消毒,用200mL/L的來蘇兒對被污染過的草場、圈舍、用具進行徹底消毒,尸體深埋。通過藥敏試驗篩選出敏感藥物對病牛進行治療,避免藥物的濫用[16]。對于健康牦牛,需做好預防工作,在牦牛養(yǎng)殖過程中,實時對牦牛的飲食狀況和健康狀況進行觀察,發(fā)現(xiàn)病情及時采取隔離措施,對疫情發(fā)生地及周邊地區(qū)的假定健康牛,采用牛巴氏桿菌滅活疫苗進行緊急免疫接種,通過科學的診斷方法進行確診,及時治療,爭取把疫病造成的損失降低到最低限度。

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