吳信明，王 艷，孫翠平，孟海濱，程立坤，韓文瑜，沈志強(qiáng)＊

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600；2.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130062；3.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600）

禽多殺性巴氏桿菌是引發(fā)禽霍亂的病原體，該病是一種侵害養(yǎng)禽業(yè)的高度接觸性傳染病，發(fā)病率和病死率都很高，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大損失［1-2］。控制禽霍亂的主要措施以疫苗接種為主，使用的疫苗主要有禽多殺性巴氏桿菌滅活疫苗、蜂膠滅活疫苗、油乳劑滅活疫苗和禽多殺性巴氏桿菌活疫苗等［3-4］。我國(guó)《獸用生物制品制造與檢驗(yàn)規(guī)程（2000版）》中規(guī)定的培養(yǎng)工藝主要是扁瓶固體培養(yǎng)法和液體發(fā)酵培養(yǎng)法［5-6］。其中，液體發(fā)酵培養(yǎng)因生產(chǎn)效率高、成本低等優(yōu)勢(shì)被廣泛采用。為了比較不同培養(yǎng)方法制備的種子液對(duì)禽多殺性巴氏桿菌大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)抗原濃度的影響，尋求科學(xué)、經(jīng)濟(jì)的種子液制備方法，本研究在培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分和溫度、pH、溶氧等培養(yǎng)條件相同的情況下，對(duì)用不同方法制備的生產(chǎn)種子液的高密度發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 禽多殺性巴氏桿菌C48-1株，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，山東綠都生物科技有限公司傳代保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉浸粉，馬丁干粉，瓊脂粉，蛋白胨等為青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；改良馬丁肉湯由山東綠都生物科技有限公司自制。

1.2 方法

1.2.1 菌種的復(fù)活與選擇

1.2.1.1 菌種的復(fù)活 將保存的菌種在馬丁固體培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)壯、純化后，接種到扁瓶中培養(yǎng)［3］。1.2.1.2 菌種的選擇 復(fù)壯后的菌種經(jīng)過形態(tài)、培養(yǎng)特性、菌型、抗原性和免疫原性鑒定，合格菌種準(zhǔn)許用于制苗；將經(jīng)鑒定符合標(biāo)準(zhǔn)的菌種接種于馬丁瓊脂固體培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，經(jīng)純粹檢查、活菌計(jì)數(shù)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)后即為種子液，用于菌苗生產(chǎn)；種子液通常保存于2℃～8℃，不得超過規(guī)程規(guī)定的使用期限［5］。

1.2.2 生產(chǎn)種子制備

1.2.2.1 一級(jí)生產(chǎn)種子制備 將凍干菌種接種于含0.1%裂解血球全血馬丁肉湯中，置36℃～37℃培養(yǎng)24h，然后劃線接種于含0.1%裂解血球全血的馬丁瓊脂平板上，選取5個(gè)以上典型菌落，接種鮮血瓊脂斜面若干支，置36℃～37℃培養(yǎng)18h，作為一級(jí)種子。在2℃～8℃保存，使用期不超過14d；在培養(yǎng)基上傳代，不超過5代［5］。

1.2.2.2 二級(jí)生產(chǎn)種子制備

1.2.2.2.1 扁瓶固體培養(yǎng)（試驗(yàn)組Ⅰ） 取一級(jí)種子接種于含0.1%裂解血球全血的改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基的扁瓶中，置37℃溫室內(nèi)培養(yǎng)18h，鏡檢后收獲，即為二級(jí)種子，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2.2 搖床液體培養(yǎng)（試驗(yàn)組Ⅱ） 取一級(jí)種子接種于含0.1%裂解血球全血的改良馬丁肉湯培養(yǎng)基的三角錐瓶中，于37℃條件下?lián)u床培養(yǎng)12h，鏡檢后收獲，作為二級(jí)種子，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2.3 發(fā)酵罐培養(yǎng)（試驗(yàn)組 Ⅲ） 取一級(jí)種子接種于含0.1%裂解血球全血的改良馬丁肉湯培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐中，參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［7-9］，確定發(fā)酵培養(yǎng)條件為：溫度為37 ℃，pH 7.2，溶氧為100%，罐壓0.05MPa，轉(zhuǎn)速為100r／min，加入培養(yǎng)基量0.1%的消泡劑，培養(yǎng)8h，收獲菌液作為二級(jí)種子，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 活菌計(jì)數(shù) 取上述3種二級(jí)生產(chǎn)種子培養(yǎng)液分別做活菌計(jì)數(shù)?；罹?jì)數(shù)采用表面培養(yǎng)測(cè)定法，參照文獻(xiàn)進(jìn)行［10］。

1.2.3 高密度發(fā)酵生產(chǎn) 使用三聯(lián)發(fā)酵罐（200L，培養(yǎng)基量為150L）進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，種子液加入量為2%。根據(jù)二級(jí)生產(chǎn)種子液活菌計(jì)數(shù)結(jié)果，用馬丁肉湯稀釋調(diào)整至3 000mL，分別加入發(fā)酵罐中，使接入總菌數(shù)保持一致，按操作規(guī)程進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。接種2h后每1h取樣鏡檢1次，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況，并在培養(yǎng)8h后，收獲培養(yǎng)液，同時(shí)取樣進(jìn)行比濁計(jì)數(shù)和活菌計(jì)數(shù)。比濁計(jì)數(shù)采用麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行［9］。重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)在 Windows XP系統(tǒng)下應(yīng)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，采用LSD多重比較進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 二級(jí)生產(chǎn)種子培養(yǎng)液活菌計(jì)數(shù)

在二級(jí)生產(chǎn)種子液制備方面，扁瓶固體培養(yǎng)的濃度最高，最高可達(dá)3.52×1010CFU／mL，平均值為3.37×1010CFU／mL，極顯著高于（P＜0.01）發(fā)酵罐培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)（表1）；發(fā)酵罐培養(yǎng)次之，但遠(yuǎn)低于扁瓶固體培養(yǎng)活菌濃度；搖床液體培養(yǎng)的最低，其活菌濃度僅為扁瓶培養(yǎng)31.2%。

2.2 高密度發(fā)酵生產(chǎn)增菌

使用麥?zhǔn)媳葷峁埽瑢?duì)高密度發(fā)酵培養(yǎng)后菌液進(jìn)行比濁計(jì)數(shù)（表2）。扁瓶固體培養(yǎng)法3批次平均值為2.38×1010CFU／mL，略高于搖床液體培養(yǎng)法（2.32×1010CFU／mL），以發(fā)酵罐培養(yǎng)增菌效果最佳，為2.68×1010CFU／mL?？梢?，不同培養(yǎng)方法增菌效果有一定差異，但未達(dá)到顯著性水平（P＞0.05）。

表1 二級(jí)生產(chǎn)種子液活菌計(jì)數(shù)結(jié)果Table 1 The viable bacterial count results of second stage seed production CFU／mL

表2 高密度發(fā)酵生產(chǎn)增菌結(jié)果（比濁計(jì)數(shù)）Table 2 The bacterial results of high-density fermentation（Turbidimetric count） CFU／mL

采用表面培養(yǎng)測(cè)定法，對(duì)高密度發(fā)酵培養(yǎng)后菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。其中，發(fā)酵罐培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)平均值達(dá)1.97×1010CFU／mL，極顯著高于其他兩種培養(yǎng)方法（P＜0.01）。扁瓶固體培養(yǎng)法與搖床液體培養(yǎng)法增菌效果相當(dāng)，3批次平均值分為1.62×1010CFU／mL和1.63×1010CFU／mL，均極顯著低于（P＜0.01）發(fā)酵罐培養(yǎng)法（表3）。

表3 高密度發(fā)酵生產(chǎn)增菌結(jié)果（活菌計(jì)數(shù)）Table 3 The bacterial results of high-density fermentation（Viable count） CFU／mL

3 討論

10L發(fā)酵罐培養(yǎng)制備的禽多殺性巴氏桿菌種子接種200L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)得的活菌數(shù)可達(dá)1.85×1010～2.05×1010CFU／mL，比濁計(jì)數(shù)為2.45×1010～2.80×1010CFU／mL；扁瓶固體培養(yǎng)法制備的種子液經(jīng)高密度發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)得的活菌數(shù)為1.56×1010～1.65×1010CFU／mL，比濁計(jì)數(shù)為2.10×1010～2.59×1010CFU／mL；而搖床液體培養(yǎng)法制備的種子液經(jīng)高密度發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)得的活菌數(shù)為1.54×1010～1.74×1010CFU／mL，比濁計(jì)數(shù)為2.10×1010～2.45×1010CFU／mL。說明10L發(fā)酵罐培養(yǎng)制備的種子液優(yōu)于扁瓶固體培養(yǎng)法和搖床液體培養(yǎng)法制備的種子液，而后兩者無明顯差別；從3批次平均值看，前者比后兩者活菌計(jì)數(shù)結(jié)果提高約21.60%，比濁計(jì)數(shù)結(jié)果提高約15.52%，比濁計(jì)數(shù)結(jié)果與活菌計(jì)數(shù)結(jié)果呈正相關(guān)性。所以采用10L發(fā)酵罐培養(yǎng)制備的禽多殺性巴氏桿菌種子進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)可顯著提高菌液濃度，增加單位抗原含量。

細(xì)菌在發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，易受環(huán)境影響，在發(fā)酵罐中培養(yǎng)，溫度、溶氧量和pH等生長(zhǎng)條件均易控制，生長(zhǎng)環(huán)境比較穩(wěn)定，所以菌體生長(zhǎng)狀況較好［8］。扁瓶固體培養(yǎng)制備的種子液中細(xì)菌已經(jīng)適應(yīng)了扁瓶的生長(zhǎng)條件，當(dāng)加入發(fā)酵罐以后，生長(zhǎng)用的培養(yǎng)基由固體轉(zhuǎn)為液體，細(xì)菌需要一定的適應(yīng)時(shí)間，這段時(shí)間稱為適應(yīng)期［9］；搖床液體培養(yǎng)時(shí)，溶氧量和pH等生長(zhǎng)條件不受控制［10-11］，細(xì)菌生長(zhǎng)靠自身調(diào)節(jié)，活性受影響，當(dāng)加入發(fā)酵罐以后，細(xì)菌也需要一定的適應(yīng)時(shí)間恢復(fù)其活性［12］。而使用小發(fā)酵罐培養(yǎng)制備的種子液接種至大發(fā)酵罐之后，培養(yǎng)基仍為液體，細(xì)菌同樣需要一定的適應(yīng)時(shí)間，但它的適應(yīng)期比前兩者要短，所以比前兩者更快地進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌液濃度較高。其他原因如細(xì)菌活力、菌齡等尚有待進(jìn)一步探討。

在實(shí)際生產(chǎn)中，扁瓶固體培養(yǎng)法制備種子有利于收集到高濃度的菌液，但存在著生產(chǎn)成本高、費(fèi)工費(fèi)力、機(jī)械化和自動(dòng)化程度低等缺點(diǎn)，很少采用；搖床液體培養(yǎng)法制備種子具有操作簡(jiǎn)單，污染易于控制等優(yōu)點(diǎn)，但其細(xì)菌生產(chǎn)緩慢，菌液濃度較低［13］；采用小型發(fā)酵罐制備生產(chǎn)種子具有生產(chǎn)效率高、菌液濃度大等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用［14］，但同時(shí)也存在對(duì)操作人員要求較高，污染風(fēng)險(xiǎn)大等缺點(diǎn)。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中可根據(jù)具體情況進(jìn)行選擇。

［1］Saif Y M.蘇禽病學(xué)［M］.敬良，高 福，索 勛，主譯.12版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2012.

［2］Lutz C，Erken M，Noorian P，et al.Environmental reservoirs and mechanisms of persistence ofVibriocholerae［J］.Front Microbiol，2013（4）：375.

［3］寧宜寶.獸用疫苗學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2008：411-418.

［4］Haley B J，Choi S Y，Grim C J，et al.Genomic and phenotypic characterization ofVibriocholeraenon-O1isolates from a US Gulf coast cholera outbreak［J］.PLoS One，2014，9（4）：e86264.

［5］中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.獸用生物制品規(guī)程2000年版［S］.2000.

［6］Akoachere J F T K，Mbuntcha C K P.Water sources as reservoirs ofVibriocholeraeO1and non-O1strains in Bepanda，Douala（Cameroon）：relationship between isolation and physico-chemical factors［J］.BMC Infect Dis，2014，14（1）：421.

［7］中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典（2010年版3部）［S］.2010.

［8］Quinn M J，Resch C T，Sun J，et al.NhaP1is a K（Na）／H antiporter required for growth and internal pH homeostasis ofVibriocholeraeat low extracellular pH［J］.Microbiology，2012，158：1094-1105.

［9］吳柏春.微生物學(xué)［M］.湖北武漢.華中師范大學(xué)出版社，2006.

［10］中國(guó)獸藥監(jiān)察所.獸用生物制品制造工［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2013.

［11］楊 帆，李秀娟，鞠洪濤.禽多殺性巴氏桿菌（G190E40株）菌液發(fā)酵參數(shù)對(duì)細(xì)菌菌數(shù)影響的探討［J］.家禽科學(xué)，2010（9）：11-13.

［12］Akoachere J F T K，Masalla T N H N.Multi-drug resistant toxigenicVibriocholeraeO1is persistent in water sources in New Bell-Douala，Cameroon［J］.BMC Infect Dis，2013，13：366.

［13］付 強(qiáng)，程立坤，苗立中，等.補(bǔ)料培養(yǎng)在豬鏈球菌疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］.中國(guó)動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（3）：133-136.

［14］肖 敏，楊 峰，王旭榮，等.分光光度法測(cè)定金黃色葡萄球菌菌液濃度方法的建立［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（11）：40-43.