趙清梅，余永濤，任 賢

（1.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川750021；2.國家民委發(fā)酵釀造工程生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川750021；3.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021）

奶牛子宮內(nèi)膜炎是奶牛產(chǎn)后常發(fā)的繁殖障礙性疾病，不僅影響奶牛繁育性能，導(dǎo)致奶牛配種困難或長期不孕，還影響奶牛泌乳量［1］、增加飼養(yǎng)成本和淘汰率，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［2］。奶牛子宮內(nèi)膜炎主要由病原微生物感染引起，細(xì)菌、真菌、支原體、病毒、立克次體、滴蟲等均可以引起奶牛子宮內(nèi)膜炎，細(xì)菌是其主要病原菌［3］。引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的細(xì)菌多達(dá)數(shù)十種，以條件致病菌大腸埃希菌、葡萄球菌、鏈球菌等為主［4］。不同地區(qū)、不同牛場和抗生素的選用，致病菌的種類和比例相差較大［5-7］。寧夏地區(qū)氣候適于奶牛養(yǎng)殖，奶牛養(yǎng)殖由最初的散戶養(yǎng)殖為主逐漸發(fā)展為規(guī)?；B(yǎng)殖，1 000頭以上大型奶牛養(yǎng)殖場不斷出現(xiàn)。隨著奶牛養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率也不斷升高。因此，寧夏奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌的分離鑒定及其抗菌藥物敏感性研究，對(duì)寧夏地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的防治具有重要意義。王桂琴等［8］從寧夏地區(qū)患病奶牛子宮內(nèi)分離的金色葡萄球菌，對(duì)大部分抗菌藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。但引起寧夏地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的病原菌種類及其他病原菌的藥物敏感性報(bào)道較少。本研究對(duì)寧夏銀川市、吳忠市規(guī)?；鲋饕≡M(jìn)行分離鑒定并研究其藥物敏感性，為寧夏地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、甘露醇高鹽瓊脂、Baird-Parker（BP）瓊脂、水解酪蛋白（MH）瓊脂、營養(yǎng)肉湯為青島海博生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；細(xì)菌生化編碼鑒定管、藥敏紙片為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922為中國藥品與生物制品檢定所產(chǎn)品；DNA聚合酶、DNA Marker DL 2 000、DNA 提取試劑盒、凝膠回收試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 S1000型PCR儀和Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病料的采集 2013年1月～2014年3月，選擇寧夏銀川市平吉堡國家奶牛園區(qū)、吳忠市金銀灘國家奶牛園區(qū)6個(gè)規(guī)?；?8頭經(jīng)臨床診斷為患子宮內(nèi)膜炎的奶牛。將患牛保定，清理糞便后，用2%的新潔爾滅溶液清洗患牛外陰部，采用直腸把握法，向子宮內(nèi)插入無菌輸精管。在輸精管的另一端接上25mL注射器，向子宮內(nèi)注入無菌生理鹽水并反復(fù)抽取數(shù)次，將抽取的液體注入已消毒的10mL離心管中，編號(hào)后置于冰盒中并盡快送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)。

1.2.2 病原菌的分離及初步鑒定 將子宮沖洗回收的液體接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37℃、200r／min振蕩培養(yǎng)過夜。然后將培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后劃線接種于麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、甘露醇高鹽瓊脂、BP瓊脂、普通瓊脂平板上，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h～24h。觀察單個(gè)菌落形態(tài)和生長特性，將菌落形態(tài)和生長特性相似的菌歸為一類，并挑取其中部分單菌落涂片，經(jīng)革蘭染色后顯微鏡檢，根據(jù)菌落和顯微形態(tài)、生長特性等對(duì)分離的各菌株進(jìn)行初步分類。

1.2.3 病原菌的生化鑒定 將純化的各菌株接種于細(xì)菌生化鑒定管中，然后放入滅菌平皿，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，觀察并記錄生化反應(yīng)結(jié)果，根據(jù)生化反應(yīng)結(jié)果對(duì)各分離菌株進(jìn)一步分類。

1.2.4 病原菌16SrDNA基因的擴(kuò)增與序列分析選取形態(tài)特點(diǎn)和生化反應(yīng)特性不同的大腸埃希菌菌株、葡萄球菌菌株、沙門菌菌株、鏈球菌菌株和棒狀桿菌分別進(jìn)行了16SrDNA序列的擴(kuò)增和測定。用 TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0提取各菌株 DNA，應(yīng)用引物Bacteria F2（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 Bacteria R2（5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）［9］擴(kuò)增細(xì)菌的16SrDNA序列。PCR反應(yīng)體系為50μL，包括DNA聚合酶1.25U，PCR緩沖 液（含 有 Mg2＋）5μL，dNTP 4μL，引 物（20μmol／L）各1μL，模板 DNA 0.25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃30s，58℃45s，72℃90s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，切取含有目的DNA 片段的瓊脂糖凝膠，用TaKaRa Gel DNA purification Kit凝膠回收試劑盒純化目的片段，將回收產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序，測序引物與PCR反應(yīng)引物相同。

將雙向測序所得的16SrDNA序列拼接并剪去引物段，然后登陸NCBI數(shù)據(jù)庫，分別將各菌株的16SrDNA序列與GenBank中已提交的菌株序列進(jìn)行同源性比較。根據(jù)同源性比較結(jié)果，選擇數(shù)據(jù)庫中同源性較高的菌株序列和相關(guān)屬菌株序列，應(yīng)用 MEGA 4.0軟件中的Clustal W程序進(jìn)行序列排列，然后應(yīng)用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 病原菌的藥物敏感性試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）測定分離菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性。取純化的大腸埃希菌和葡萄球菌各菌株分別接種于普通肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后用無菌生理鹽水將其稀釋為1.5×108CFU／mL。用無菌棉簽蘸取稀釋好的菌液均勻涂布于MH平板表面，置培養(yǎng)箱中靜置5min。然后用無菌鑷子夾取各藥敏片貼于平板表面。每個(gè)平皿放置3個(gè)～5個(gè)藥敏片，每種藥物設(shè)3個(gè)重復(fù)。將貼有藥敏片的平皿置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)18h～24h，記錄抑菌圈的直徑。同時(shí)使用大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923作為質(zhì)控菌，依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）制定的標(biāo)準(zhǔn)［10］，通過抑菌圈直徑的大小來判定病原菌對(duì)藥物的敏感性，將其分為耐藥（R）、中度敏感（I）和高度敏感（S）。藥敏試驗(yàn)中未列入CLSI的部分抗菌藥，其結(jié)果判定參考同類藥物判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 病原菌分離和初步分類及生化鑒定結(jié)果

本試驗(yàn)共從78頭患牛的子宮分泌物中分離出菌株117株，根據(jù)形態(tài)特點(diǎn)和生化鑒定結(jié)果，確定大腸埃希菌為65株，檢出率為55.56%，葡萄球菌42株，檢出率為35.90%，鏈球菌7株，檢出率為5.98%，沙門菌2株，檢出率為1.71%，棒狀桿菌1株，檢出率為0.85%。其中單一菌株感染的患牛為33頭，感染率為42.31%，混合感染的患牛為41頭，感染率為52.56%，另有4頭沒有分離出細(xì)菌（表1）。

此外，形態(tài)特點(diǎn)和生化鑒定結(jié)果表明，大腸埃希菌代表株4株，葡萄球菌代表株4株，沙門菌代表株2株，鏈球菌代表株2株，棒狀桿菌代表株1株。

表1 奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌分離和生化鑒定結(jié)果Table 1 Isolation and biochemical identification results ofpathogenic bacteria in dairy cows with endometritis

2.2 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

分子生物學(xué)鑒定結(jié)果顯示，應(yīng)用Bacteria F2和Bacteria R2引物對(duì)能成功擴(kuò)增所有菌株的16SrDNA序列，各菌株的16SrDNA序列片段長度約為1.4kb～1.5kb（圖1）。

圖1 部分菌株的16SrDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR results of 16SrDNA for some pathogenic bacteria from cows with endometritis

16SrDNA的序列比對(duì)和遺傳發(fā)育分析結(jié)果表明，01、05、06、08號(hào)大腸埃希菌菌株與埃希屬同源性最高（99%～100%），親緣關(guān)系最近（圖2A），均為大腸埃希菌。03、17、21、23號(hào)葡萄球菌菌株均與金黃色葡萄球菌的同源性最高99%～100%，在遺傳進(jìn)化樹中與金色葡萄球菌同處于一個(gè)分支，確定該4株葡萄球菌均為金黃色葡萄球菌（圖2B）。19、47號(hào)沙門菌菌株與腸道沙門菌的同源性最高（99%），親緣關(guān)系最近（圖2A），均為腸道沙門菌。15、34號(hào)鏈球菌菌株與無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌的同源性高達(dá)99%～100%，15號(hào)菌株與無乳鏈球菌處于相同的進(jìn)化樹分支上，而34號(hào)菌株與停乳鏈球菌處于相同的進(jìn)化樹分支上（圖2C），確定該2株菌分別為無乳鏈球菌和停乳鏈球菌。分離的7株鏈球菌，6株與15號(hào)菌株形態(tài)和生化反應(yīng)一致為無乳鏈球菌，1株與34號(hào)菌株形態(tài)和生化反應(yīng)一致為停乳鏈球菌。41號(hào)棒狀桿菌與數(shù)據(jù)庫中的化膿棒狀桿菌同源性最高（100%），親緣關(guān)系最近（圖2D），確定該菌株為化膿棒狀桿菌。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，大腸埃希菌對(duì)頭孢唑啉、頭孢西丁、頭孢噻肟等頭孢類抗生素較敏感，其耐藥率均小于20%；對(duì)氨芐西林、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、鏈霉素、卡拉霉素均有不同程度的耐藥，其中對(duì)氨芐西林和四環(huán)素耐藥率較高，耐藥率均大于80%，對(duì)環(huán)丙沙星、氧氟沙星、復(fù)方新諾明、鏈霉素、卡拉霉素耐藥率大于50%。葡萄球菌對(duì)萬古霉素、頭孢西丁、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等藥物較敏感，其耐藥率小于20%。對(duì)紅霉素、麥迪霉素、青霉素G、氨芐西林、頭孢唑啉、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明均出現(xiàn)不同程度的耐藥，其中對(duì)青霉素G、氨芐西林、四環(huán)素、復(fù)方新諾明耐藥率較高，均大于50%（表2）。

3 討論

李宏勝等［11］報(bào)道，引起蘭州地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要病原菌為化膿隱秘桿菌、大腸埃希菌、屎腸球菌、無乳鏈球菌，以單一感染為主。胡文舉等［12］報(bào)道，引起河南平頂山奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要病原菌為蠟樣芽胞桿菌、大腸埃希菌、奧斯陸莫拉菌等，以單一感染為主。李潤元等［13］報(bào)道，引起錫林浩特市周邊地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要病原菌為葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、化膿棒狀桿菌、變形桿菌等，以混合感染為主。張銀亮等［14］報(bào)道，引起新疆北部地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要病原菌為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、蠟樣芽胞桿菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌。本研究從寧夏吳忠市、銀川市規(guī)?；?8頭患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮沖洗液中，分離出65株大腸埃希菌（55.56%）、42株金色葡萄球菌（35.9%）、6株無乳鏈球菌、1株停乳鏈球菌、2株腸道沙門菌、1株化膿棒狀桿菌。引起寧夏地區(qū)規(guī)?；瞿膛Ｗ訉m內(nèi)膜炎的主要病原菌為大腸埃希菌和金色葡萄球菌，混合感染的比例較高（52.56%），單一感染（42.31%）以大腸埃希菌為主，葡萄球菌和分離的其他細(xì)菌主要為混合感染。本次試驗(yàn)分離到的病原菌種類和比例與上述報(bào)道存在部分差異，引起這些差異的原因可能與各地衛(wèi)生狀況、采樣時(shí)間、病原菌分離鑒定方法以及鑒定者的經(jīng)驗(yàn)等方面有關(guān)。本研究分離的細(xì)菌多為廣泛存在于環(huán)境中及畜體內(nèi)的常見菌，其中有些是條件性致病菌?？梢娨饘幭牡貐^(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎主要原因是奶牛產(chǎn)后體質(zhì)虛弱、免疫力下降，環(huán)境中及畜體內(nèi)病原微生物乘機(jī)侵入而致。因此，牛場應(yīng)加強(qiáng)奶牛產(chǎn)后飼養(yǎng)管理，增強(qiáng)奶牛產(chǎn)后免疫力，定期對(duì)環(huán)境進(jìn)行消毒，減少致病菌的傳播。

圖2 奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌的遺傳進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of pathogenic bacteria in dairy cows with endometritis

表2 42株金色葡萄球菌和65株大腸埃希菌對(duì)常用抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug sensitivity test results of 42 S.aureus strains and 65 E.coli strains to commonly used antimicrobial drugs %

不同地域、不同牛場，甚至同一牛場不同季節(jié)引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的病原菌均不相同。因此，病原菌快速準(zhǔn)確的鑒定，以及敏感藥物的篩選，可有效避免抗菌藥物的濫用，降低細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌鑒定方法主要以生化鑒定為主，近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，16SrDNA序列分析逐漸用于該領(lǐng)域病原菌的鑒定研究。張洪波等［15］、王孝武等［16］用16SrDNA 序列分析法對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌進(jìn)行鑒定，鑒定的病原菌種類與報(bào)道的基本一致。本研究中作者發(fā)現(xiàn)，由于作者經(jīng)驗(yàn)不足，試驗(yàn)過程中假陽性的出現(xiàn)，以及同屬不同種的細(xì)菌生化反應(yīng)結(jié)果可能并不完全一致，僅通過形態(tài)和生化反應(yīng)很難準(zhǔn)確判斷。本研究先通過形態(tài)學(xué)和生化鑒定對(duì)病原菌進(jìn)行初步鑒定歸類，再選取形態(tài)和生化反應(yīng)有差異的同一屬細(xì)菌采用16SrDNA序列分析方法對(duì)其進(jìn)一步鑒定，同時(shí)確定其進(jìn)化地位，為進(jìn)一步研究其遺傳背景、菌株間親緣關(guān)系和致病機(jī)制提供理論依據(jù)。研究結(jié)果顯示，選取的4株大腸埃希菌均為大腸埃希菌，4株葡萄球菌均為金色葡萄球菌，2株鏈球菌分別為無乳鏈球菌和停乳鏈球菌，2株沙門菌均為腸道沙門菌，1株棒狀桿菌為化膿棒狀桿菌。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，大腸埃希菌對(duì)頭孢唑啉、頭孢西丁、頭孢噻肟等頭孢類抗生素較敏感，對(duì)氨芐西林耐藥率均較高，可能與牛場頻繁使用這種藥物，導(dǎo)致超抗基因的產(chǎn)生有關(guān)［17］。萬古霉素、頭孢西丁、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星對(duì)金色葡萄球菌抑菌效果較好，敏感率大于80%，與王桂琴等［6］報(bào)道的寧夏奶牛子宮內(nèi)膜炎金色葡萄球菌對(duì)萬古霉素、氟喹諾酮類和頭孢類抗生素敏感率在60%以上基本一致。本研究中金色葡萄球菌對(duì)四環(huán)素的敏感率小于30%，與王桂琴等報(bào)道大于60%不一致，可能與分離的季節(jié)和牛場不同等因素有關(guān)。本次分離的病原菌中鏈球菌、腸道沙門菌、化膿棒狀桿菌所占比例較小，故沒做藥敏試驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)，從寧夏銀川市和吳忠市規(guī)?；龇蛛x出的奶牛子宮內(nèi)膜炎主要病原菌及其對(duì)抗菌藥物的耐藥情況無顯著差異，可能與銀川和吳忠市距離較近，牛場之間常有交流，用藥情況大致相似有關(guān)。

綜上所述，本研究中6個(gè)規(guī)?；瞿膛Ｗ訉m內(nèi)膜炎致病菌主要為大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌，且以混合感染為主。大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素G、氨芐西林、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、鏈霉素、卡拉霉素的耐藥性較強(qiáng)，對(duì)萬古霉素、頭孢西丁、頭孢噻肟較敏感。

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