徐陸忠，嚴(yán)鶯，周學(xué)琴

(上海市第十人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，上海 200072)

HPLC-ELSD法測(cè)定人工牛黃甲硝唑膠囊中膽酸和豬去氧膽酸的含量

徐陸忠，嚴(yán)鶯，周學(xué)琴

(上海市第十人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，上海 200072)

目的 建立高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)法測(cè)定人工牛黃甲硝唑膠囊中膽酸和豬去氧膽酸的含量。 方法 色譜柱為Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-1%冰醋酸溶液(80：20)；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；漂移管溫度為80 ℃；氮?dú)饬魉贋?.0 L·min-1。 結(jié)果 膽酸在1.188～17.820 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=0.999 3，平均回收率為98.04%，RSD=1.60%(n=6)；豬去氧膽酸在1.026～15.383 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=0.999 8，平均回收率為99.03%，RSD=2.06%(n=6)。 結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為人工牛黃甲硝唑膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供依據(jù)。

人工牛黃甲硝唑膠囊；膽酸；豬去氧膽酸；檢測(cè)器，高效液相色譜-蒸發(fā)光散射；含量測(cè)定

人工牛黃甲硝唑膠囊為國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)收載的中西藥復(fù)方制劑，由人工牛黃和甲硝唑組成，臨床主要用于急性智齒冠周炎、局部牙槽膿腫、牙髓炎、根尖周炎的治療?，F(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)測(cè)定膽紅素的含量控制該制劑中人工牛黃的質(zhì)量，但是膽紅素僅僅是人工牛黃諸多有效成分之一，單純測(cè)定膽紅素的量不能全面反映該制劑中人工牛黃的品質(zhì)。膽酸和豬去氧膽酸是人工牛黃的重要組成成分，兩者的含量直接影響人工牛黃的品質(zhì)。因此，為了更好地控制人工牛黃甲硝唑膠囊的質(zhì)量，參考文獻(xiàn)[1-4]，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector，HPLC-ELSD)法測(cè)定制劑中膽酸和豬去氧膽酸的含量，為進(jìn)一步完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；Alltech 2000ES 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)Alltech公司)；XS205 Dual Range十萬(wàn)分之一分析天平(METTLER TOLEDO公司)；USC-502超聲波清洗儀(上海波龍電子設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥 膽酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100078-200414，含量：98.0%)；豬去氧膽酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100087-200610，含量：97.3%)；人工牛黃甲硝唑膠囊(收集于不同廠家，5批)；甲醇為色譜純，水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-1%冰醋酸溶液(80：20)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；漂移管溫度：80 ℃；氮?dú)饬魉伲?.0 L·min-1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取膽酸對(duì)照品29.70 mg、豬去氧膽酸對(duì)照品26.35 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱取適量(相當(dāng)于人工牛黃25 mg)，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性溶液的制備 取缺牛膽粉、膽酸和豬去氧膽酸3種原料的人工牛黃，按處方比例與甲硝唑及輔料混勻，按“2.3”項(xiàng)方法制備陰性溶液。

2.5 方法專屬性考察 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖1。膽酸和豬去氧膽酸與供試品溶液中的其他組分達(dá)到基線分離，且陰性溶液在膽酸和豬去氧膽酸相應(yīng)保留時(shí)間處無(wú)干擾峰，表明該方法專屬性好。

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液2，6，10，20，30 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定膽酸和豬去氧膽酸峰面積，以進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，膽酸的回歸方程為Y=1.612 9X+12.473，r=0.999 3，豬去氧膽酸的回歸方程為Y=1.658 5X+12.776，r=0.999 8，表明膽酸和豬去氧膽酸分別在1.188～17.820，1.026～15.383 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

A.陰性溶液；B.對(duì)照品溶液；C.供試品溶液；1.豬去氧膽酸；2.膽酸

2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果，膽酸和豬去氧膽酸峰面積的RSD分別為0.32%，0.24%，表明精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液20 μL，于0，2，4，6，8，10，12 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果，膽酸和豬去氧膽酸峰面積的RSD分別為1.26%，1.41%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品6份，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定并計(jì)算含量。結(jié)果，膽酸和豬去氧膽酸含量的RSD分別為0.78%，0.61%，表明本方法重復(fù)性較好。

2.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批供試品6份，精密加入對(duì)照品溶液2.0 mL，再精密加入甲醇8.0 mL按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算膽酸和豬去氧膽酸平均回收率分別為98.04%，99.03%，RSD分別為1.60%，2.06%。見(jiàn)表1，2。

表1 膽酸加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.11 樣品的含量測(cè)定 分別取5個(gè)廠家的5批人工牛黃甲硝唑膠囊，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，按外標(biāo)兩點(diǎn)對(duì)數(shù)法計(jì)算每粒樣品中膽酸和豬去氧膽酸的含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

膽酸類成分在醇類溶劑中具有較高溶解度，因此，供試品溶液制備時(shí)選擇了甲醇作為提取溶劑，考察了超聲、加熱回流兩種提取方法，結(jié)果超聲提取時(shí)膽酸和豬去氧膽酸的回收率較高。

表2 豬去氧膽酸加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 5個(gè)廠家每粒樣品中膽酸和豬去氧膽酸測(cè)定結(jié)果

mg，n=3

流動(dòng)相選擇時(shí)，比較了甲醇-乙腈-0.5%冰醋酸溶液(49：20：31)、甲醇-1%冰醋酸溶液(80：20)、乙腈-0.5%冰醋酸溶液(40：60)等多組流動(dòng)相，結(jié)果顯示以甲醇-1%冰醋酸溶液(80：20)為流動(dòng)相時(shí)，出峰時(shí)間適宜，色譜峰對(duì)稱性好，且能與其他組分實(shí)現(xiàn)基線分離。膽酸和豬去氧膽酸含量較低，因此，ELSD選擇不分流模式，且通過(guò)調(diào)節(jié)漂移管溫度和氮?dú)饬魉伲_保在較低的基線噪音前提下，使膽酸和豬去氧膽酸具有較高的響應(yīng)值。

通過(guò)對(duì)市售的人工牛黃甲硝唑膠囊中膽酸和豬去氧膽酸測(cè)定，結(jié)果各個(gè)廠家之間具有較大差異。《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版雖然對(duì)人工牛黃提出較高的質(zhì)量要求，但現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)含人工牛黃的制劑仍以膽紅素這單一指標(biāo)進(jìn)行控制，顯然不足以全面反映該類制劑的質(zhì)量，通過(guò)HPLC-ELSD法測(cè)定膽酸和豬去氧膽酸的含量，可為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供依據(jù)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：1106-1107.

[2] 鐘名誠(chéng)，肖聰，于境.HPLC-ELSD法測(cè)定膽黃片中豬去氧膽酸的含量[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2010，11(2)：121-124.

[3] KONG W J，JIN C，XIAO X H，et al.Determination of multi-component contents inCalculusbovisby ultra-performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection and its application for quality control[J].J Separat Sci，2010，33(10)：1518-1527.

[4] 石巖，孫冬梅，魏鋒，等.體外培育牛黃中主要膽酸類成分的測(cè)定[J].藥物分析雜志，2013，33(6)：1045-1047.

DOI 10.3870/yydb.2015.05.024

2014-02-08

2014-05-01

徐陸忠(1983-)，女，浙江湖州人，藥師，碩士，研究方向：藥物新劑型及新技術(shù)。電話：021-66307704，E-mail：xuluzhong_83@126.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)05-0658-03