郭旭光，鄭子棟，郭毅

(河南省食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州 450003)

高效液相色譜梯度洗脫法測(cè)定水楊酸復(fù)合洗劑中的有關(guān)物質(zhì)

郭旭光，鄭子棟，郭毅

(河南省食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州 450003)

目的 建立梯度洗脫的高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定水楊酸復(fù)合洗劑中的有關(guān)物質(zhì)。方法 采用Agela C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以0.5%磷酸溶液(A)、甲醇(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，柱溫為35 ℃。結(jié)果 該方法可快速有效分離水楊酸復(fù)合洗劑中各有關(guān)物質(zhì)。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、靈敏、快速、專屬性強(qiáng)，可以用于控制該產(chǎn)品質(zhì)量。

水楊酸復(fù)合洗劑；梯度洗脫；色譜法，高效液相

水楊酸復(fù)合洗劑具有止癢、殺菌的作用，用于真菌感染的手、足癬的治療，療效好，價(jià)格便宜?，F(xiàn)行水楊酸復(fù)合洗劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)沒有對(duì)其有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢定[1]，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)采用高效液相色譜梯度洗脫法對(duì)水楊酸復(fù)合洗劑的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定[2-10]，本方法快速，簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，可以更好地控制該產(chǎn)品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司);G1314A VWD可變波長(zhǎng)檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司)；Agilent chem Station色譜工作站。

1.2 試藥 苯甲酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100419-200301，含量：100%)，水楊酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100106-201104，含量：100%)，4-羥基苯甲酸對(duì)照品(Acros公司，批號(hào)：A0282187，含量：99.8%)，4-羥基異酞酸對(duì)照品(東京化成工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：DLTTC，含量：99.4%)，苯酚對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100509-200902，含量：100%)，水楊酸復(fù)合洗劑(市售，批號(hào)：130101，130102，130103)，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agela C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為0.5%磷酸溶液，流動(dòng)相B為甲醇，線性梯度洗脫程序見表1；柱溫：35 ℃；流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；進(jìn)樣體積為10 μL。

2.2 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取苯甲酸、水楊酸、4-羥基苯甲酸、4-羥基異酞酸及苯酚對(duì)照品適量，置同一量瓶中，用0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液溶解稀釋制成濃度為16 μg·mL-1的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，相鄰峰的分離度均>1.5。

表1 梯度洗脫程序

%

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn)

破壞性實(shí)驗(yàn) 儲(chǔ)備液的制備：精密稱取粉劑300 mg，置20 mL量瓶中，用0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液溶解，稀釋至刻度，搖勻。

酸破壞：精密量取儲(chǔ)備液2 mL，置5 mL量瓶中，加1 mol·L-1鹽酸1 mL放置2 h后用1 mol·L-1氫氧化鈉調(diào)pH至中性，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液稀釋至刻度，搖勻，用孔徑0.2 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按上述色譜條件測(cè)定。

堿破壞：精密量取儲(chǔ)備液2 mL，置5 mL量瓶中，加1 mol·L-1氫氧化鈉1 mL放置2 h后用1 mol·L-1鹽酸調(diào)pH至中性，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液稀釋至刻度，搖勻，用孔徑0.2 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按上述色譜條件測(cè)定。

氧化破壞：取儲(chǔ)備液2 mL，置5 mL量瓶中，加30%過氧化氫1 mL，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液稀釋至刻度，搖勻，放置0.5 h后，用孔徑0.2 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按上述色譜條件測(cè)定。

高溫破壞：取儲(chǔ)備液2 mL，置5 mL量瓶中，60 ℃水浴2 h，放至室溫，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液稀釋至刻度，搖勻，用孔徑0.2 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按上述色譜條件測(cè)定。

光照破壞：取儲(chǔ)備液2 mL，置5 mL量瓶中，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液稀釋至刻度，搖勻，于4 000 lx光照2 h，放至室溫，用孔徑0.2 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按上述色譜條件測(cè)定。

結(jié)果各破壞條件下的降解物與主峰分離均良好。

2.4 線性范圍考察 精密稱取苯甲酸、水楊酸、4-羥基苯甲酸、4-羥基異酞酸和苯酚對(duì)照品各20 mg置同一50 mL量瓶中，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置于50 mL量瓶中，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液稀釋至刻度，搖勻。精密量取0.5，2.0，3.0，5.0，7.0，9.0 mL分別置10 mL量瓶中，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，以濃度C(μg·mL-1)對(duì)峰面積A進(jìn)行線性回歸，分別得苯甲酸、水楊酸、4-羥基苯甲酸、4-羥基異酞酸和苯酚的線性回歸方程：

A=2.720 4C+0.320 1，R2=0.999 9(n=6)；

A=3.479 5C+0.675 4，R2=0.999 6(n=6)；

A=63.047C+6.185 5，R2=0.999 8(n=6)；

A=37.58C-3.457 1，R2=0.999 9(n=6)；

A=3.292 3C+0.459 6，R2=0.999 8(n=6)。

結(jié)果表明，苯甲酸、水楊酸、4-羥基苯甲酸、4-羥基異酞酸和苯酚分別在2.109～37.962 μg·mL-1、1.989～35.802 μg·mL-1、1.982～35.676 μg·mL-1、2.018～36.324 μg·mL-1和2.234～40.212 μg·mL-1范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下的系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖，測(cè)得苯甲酸、水楊酸、4-羥基苯甲酸、4-羥基異酞酸和苯酚峰面積的RSD 分別為0.8%，0.5%，0.6%，0.5%和0.4%，結(jié)果表明此法精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取水楊酸復(fù)合洗劑(批號(hào)：130101)6份，制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定6份樣品有關(guān)物質(zhì)總峰面積、雜質(zhì)個(gè)數(shù)、單個(gè)雜質(zhì)量、雜質(zhì)總量。結(jié)果總峰面積平均值為14 536.5，RSD為0.9%；雜質(zhì)個(gè)數(shù)均為5個(gè)；單個(gè)雜質(zhì)量基本沒有變化；雜質(zhì)總量平均值為0.55%，RSD為0.2%。

2.7 檢測(cè)限和定量限 以信噪比為3：1，測(cè)得苯甲酸、水楊酸、4-羥基苯甲酸、4-羥基異酞酸和苯酚檢測(cè)限分別為4.22，3.98，0.124，0.448和4.47 ng；定量限分別為12.78，12.06，0.37，1.49和13.45 ng。

2.8 溶液穩(wěn)定性 選取2批樣品(批號(hào)：130101，130102)進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，供試品溶液在常溫下放置24 h，2批樣品的雜質(zhì)峰數(shù)目、單個(gè)雜質(zhì)的峰面積和雜質(zhì)總量均無(wú)變化(RSD=0.04%)，說明溶液在常溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 耐用性 選用2根不同品牌的C18柱，Agela Venusil ASB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Agilent Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，在2臺(tái)儀器(Agilent 1100型高效液相色譜儀和Waters 2695型高效液相色譜儀)上測(cè)定3批樣品的有關(guān)物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)不同色譜柱檢測(cè)到的雜質(zhì)數(shù)目、出峰順序、分離效果和峰面積均無(wú)明顯變化。

2.10 樣品測(cè)定 取本品適量，精密稱定，用0.5%磷酸溶液：甲醇(1：1)混合溶液定量稀釋制成每毫升中含水楊酸約2 mg的溶液，搖勻，用孔徑0.2 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；精密量取供試品溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，0.5%磷酸溶液：甲醇(1：1)混合溶液稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)孔徑0.2 μm濾膜濾過，將濾液作為對(duì)照溶液。按上述色譜條件測(cè)定，分別取對(duì)照溶液及供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，單個(gè)雜質(zhì)峰的峰面積不得大于對(duì)照溶液中水楊酸主峰面積的0.5倍；各雜質(zhì)峰的面積之和不得大于對(duì)照溶液中水楊酸峰面積的3倍。用自身對(duì)照法計(jì)算各雜質(zhì)的含量，3批有關(guān)物質(zhì)均符合規(guī)定，見表2。

3 討論

筆者比較了4種不同流動(dòng)相系統(tǒng)：①甲醇-水-冰醋酸(60：40：1)[2]；②甲醇-水-冰醋酸(40：60：1)[3]；③20 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液(用20%磷酸調(diào)節(jié)pH為2.7)-甲醇(40：60)；④以0.5%磷酸溶液

表2 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果 %

(A)、甲醇(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫。結(jié)果流動(dòng)相①、②和③部分色譜峰的分離度<1.5，并且基線較高且有漂移，半峰寬較大，峰拖尾因子不理想，水楊酸峰后出現(xiàn)一較大寬峰；采用流動(dòng)相④梯度洗脫后基線漂移現(xiàn)象得到改善，水楊酸后的大寬峰得以改善，主峰及各雜質(zhì)峰之間均分離良好；筆者嘗試用0.5%三氟乙酸溶液和0.5%醋酸溶液替代流動(dòng)相④中的0.5%磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果流動(dòng)相A為0.5%三氟乙酸溶液時(shí)圖譜中各峰的分離度均>4.0，分離度較好且柱效高，但是基線噪音大；用0.5%醋酸溶液以同樣梯度洗脫，結(jié)果苯甲酸和水楊酸分離不完全。嘗試改變梯度程序，主峰保留時(shí)間、檢出雜質(zhì)峰個(gè)數(shù)及分離度均有所不同，綜合考慮以上因素并結(jié)合柱效和拖尾因子，最終確定流動(dòng)相④的梯度洗脫程序最優(yōu)，筆者選擇流動(dòng)相④梯度洗脫作為該產(chǎn)品流動(dòng)相系統(tǒng)。

分別精密稱取兩份水楊酸復(fù)合洗劑樣品(批號(hào)：130101)分別用溶劑A[0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液]和溶劑B(50%甲醇)稀釋制成每毫升含水楊酸約2 mg的溶液，按本文色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果溶劑B稀釋的樣品色譜圖中苯甲酸和水楊酸兩主峰分離不完全；用溶劑A稀釋后的色譜圖，主峰之間及與雜質(zhì)峰均分離完好，故確定溶劑A為本文方法溶劑。

采用DAD檢測(cè)器對(duì)供試品溶液色譜圖中的各雜質(zhì)峰和主峰的最大紫外吸收進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)實(shí)驗(yàn)圖譜中各峰的紫外吸收主要集中在254，270和230 nm附近，在這3個(gè)波長(zhǎng)處，各雜質(zhì)的吸收大小程度不同，分別對(duì)同一份供試品進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)測(cè)定，結(jié)果表明在270 nm波長(zhǎng)處單個(gè)雜質(zhì)峰的面積百分比均較大，檢出的總雜質(zhì)量最多，為了更多地檢出雜質(zhì)，更有效地控制該產(chǎn)品質(zhì)量，選擇270 nm為有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)波長(zhǎng)。

本品的藥效成分是苯甲酸、水楊酸、硼酸和乳酸。苯甲酸和水楊酸具有紫外吸收，筆者依此并參考相關(guān)文獻(xiàn)建立了高效液相色譜梯度洗脫法測(cè)定其有關(guān)物質(zhì)[2-10]，因硼酸和乳酸沒有紫外吸收，其有關(guān)物質(zhì)暫時(shí)還沒有檢測(cè)方法；4-羥基苯甲酸、4-羥基異酞酸和苯酚均為已知雜質(zhì)，含量均<0.5%，其他雜質(zhì)檢出量均非常微小，本研究共檢出兩個(gè)單個(gè)未知雜質(zhì)，其結(jié)構(gòu)和歸屬有待進(jìn)一步研究，兩個(gè)未知單個(gè)雜質(zhì)均暫以主成分水楊酸峰面積計(jì)算。參照《中華人民共和國(guó)藥典》[2]水楊酸原料標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)雜質(zhì)A(4-羥基苯甲酸)、雜質(zhì)B(4-羥基異酞酸)、雜質(zhì)C(苯酚)的限度規(guī)定，確定本品單個(gè)雜質(zhì)的限度不超過0.5%，以更好地控制該產(chǎn)品質(zhì)量。

破壞性實(shí)驗(yàn)表明本品在強(qiáng)酸堿和氧化條件下均有降解，光破壞和高溫破壞幾乎沒有降解，說明儲(chǔ)存過程中要避免強(qiáng)酸堿條件并應(yīng)密封保存，考慮到苯甲酸和水楊酸均為小分子物質(zhì)，降解后可能沒有紫外吸收，所以有關(guān)物質(zhì)和含量測(cè)定相結(jié)合以進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)更有意義。

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DOI 10.3870/yydb.2015.05.026

2014-02-21

2014-04-26

郭旭光(1972-)，男，河南襄城人，主管藥師，碩士，主要研究方向：食品、藥品質(zhì)量控制。電話：0371-63388290，E-mail：gxg0371@126.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)05-0664-03