劉東旭，李健明，時(shí) 坤，曾范利，劉 菲，杜 銳

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

水貂是一種珍貴的毛皮動(dòng)物，其皮毛是國(guó)際裘皮市場(chǎng)的三大支柱之一，素有“裘皮之王”的美譽(yù)。目前市場(chǎng)流通的水貂皮主要是依靠人工養(yǎng)殖水貂而得。水貂阿留申?。ˋleutian disease of mink，AD）又名漿細(xì)胞增多癥，是由細(xì)小病毒科（Parvoviridae）、阿留申貂病毒屬（Amdovirus）的水貂阿留申病毒（Aleutian disease viruses，ADV）引起的一種慢性、病毒性傳染?。?］。該病自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，世界多地的水貂養(yǎng)殖場(chǎng)均發(fā)現(xiàn)阿留申病，給水貂養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2］。ADV感染水貂后，水貂體內(nèi)不產(chǎn)生或只產(chǎn)生少量的中和抗體，而產(chǎn)生的多數(shù)抗體不僅不能具有中和病毒的毒力，反而通過介導(dǎo)抗體依賴性增強(qiáng)作用，進(jìn)一步幫助ADV對(duì)靶細(xì)胞的侵染［3］。而且，由于病毒抗原與抗體形成的復(fù)合物（immune complex，IC）特有的理化特點(diǎn)可導(dǎo)致IC沉積并引發(fā)腎小球腎炎和動(dòng)脈炎。這些都對(duì)基于病毒粒子構(gòu)建疫苗帶來(lái)了許多的困難［4］。對(duì)此，國(guó)外學(xué)者認(rèn)為基于病毒衣殼構(gòu)建疫苗應(yīng)該是無(wú)效的，許多嘗試也證明了這一點(diǎn)［5］。因?yàn)锳DV特有的致病機(jī)理，研制開發(fā)針對(duì)ADV的疫苗，一直是動(dòng)物醫(yī)學(xué)界很棘手的問題［6-7］。

本試驗(yàn)根據(jù)GenBank上公布的不同ADV毒株基因序列，設(shè)計(jì)12對(duì)引物，對(duì)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疾病實(shí)驗(yàn)室分離和鑒定具有致病性的水貂阿留申病毒進(jìn)行全基因擴(kuò)增、測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研制有效防控水貂阿留申病弱毒疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 UNIQ-10柱式病毒基因組抽提試劑盒為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；pMD18-T Vector、感受態(tài)細(xì)胞JM109、T4DNA連接酶、DNA Marker DL 2 000、ExTaqDNA 聚合酶、dNTP為TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒、溴化乙錠（EB）、瓊脂糖、瓊脂粉為維特杰公司產(chǎn)品。

1.1.2 病毒 由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疾病實(shí)驗(yàn)室所分離和保存的5株具有致病性的水貂阿留申病病毒分離株 ，分別命名為 ADV-DL124、ADVDL125、ADV-Z3、ADV-Q2、ADV-Q3。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank上公布的不同ADV全基因序列（ADV-G登錄號(hào)：M20036、NC001662；ADV-Utah登錄號(hào)：Z18276；ADV-SL3登錄號(hào)：X97629），設(shè)計(jì)12對(duì)引物進(jìn)行全基因擴(kuò)增。各個(gè)引物序列及相對(duì)于ADV-G毒株全序列的位置如表1所示。

1.2.2 目的片段的克隆及測(cè)序 使用UNIQ-10柱式病毒基因組抽提試劑盒，按照說明書，提取病毒的DNA。以提取的病毒DNA為模板，用12對(duì)引物進(jìn)行全基因組分段擴(kuò)增，擴(kuò)增的退火溫度分別為：55.6、52.6、51.1、54、51.5、57、54.9、54.2、52.6、56、58.7和55.7℃。將PCR產(chǎn)物純化后，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色單菌落搖菌、提質(zhì)粒，經(jīng)鑒定后的重組質(zhì)粒送至上海生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 序列分析 利用DNA Star將5株病毒的全基因序列，與GenBank中ADV參考序列，進(jìn)行核苷酸序列分析及同源性比較，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，分析我國(guó)毒株與其他國(guó)家和地區(qū)流行毒株的關(guān)系。同樣利用DNA Star將本實(shí)驗(yàn)室分離的毒株、ADV參考毒株以及細(xì)小病毒亞科各屬代表種的全基因序列推導(dǎo)核苷酸序列并進(jìn)行分析及同源性比較，構(gòu)建相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，分析ADV與其他各屬成員的進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

應(yīng)用設(shè)計(jì)的引物對(duì)ADV分離株的全基因進(jìn)行分段PCR擴(kuò)增，獲得目的片段均與預(yù)期結(jié)果相符（表1），擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。

表1 分段擴(kuò)增所用的引物序列及對(duì)應(yīng)Table 1 Primer sequences used in fragment amplification

2.2 ADV分離株與參考毒株的序列分析

用DNA Star軟件中的seqMan程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到分離株的全基因序列。用DNA Star軟件MegAlign程序中的Clustal W Method將分離株核苷酸序列和病毒參考株的對(duì)應(yīng)全序列進(jìn)行同源性比較和構(gòu)建進(jìn)化樹。本研究使用的參考毒株序列來(lái)源于GenBank，病毒歸屬、名稱和登錄號(hào)見表2，同源性分析結(jié)果見圖2。

ADV分離株序列分析結(jié)果表明，在232-255、408-442、3 105-3 138bp等處與參考株差異比較大。ADV-Q2在1 569-1 574bp處有5個(gè)基因的插入，除了ADV-Z3分離株外，其他分離株在1 977bp處均有基因缺失。ADV-DL124、ADV-DL125與參考毒株ADV-LN1相同，在2 493-2 523bp處有30bp左右的基因缺失。ADV-Q3在4 365-4 373bp處有基因插入。本試驗(yàn)用到的5個(gè)毒株之間，同源性最低的ADV-DL124和ADV-Z3之間為93.1%，且部分實(shí)驗(yàn)室分離毒株與致病毒株間同源率較低，這與國(guó)外學(xué)者的研究結(jié)果一致［8］。

圖1 全基因各分段PCR結(jié)果Fig.1 PCR results of different segments of the whole genome of ADV

表2 所引用的ADV毒株一覽表Table 2 List of ADV strains used as references in this study

圖2 試驗(yàn)株與參考株的同源性分析Fig.2 Homology analysis of ADV isolates with the reference strains

2.3 ADV毒株與細(xì)小病毒亞科其他屬代表毒株的序列比較

用DNA Star軟件MegAlign程序中的Clustal W method將分離毒株核苷酸序列與ADV參考株序列以及細(xì)小病毒其他4個(gè)屬的代表毒株全序列進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化樹分析。其他屬的毒株序列均來(lái)源于GenBank，病毒名稱、縮寫和登錄號(hào)見表3，根據(jù)序列比對(duì)的結(jié)果構(gòu)建的進(jìn)化樹（圖3）。由圖3可知，17株病毒可劃歸為3個(gè)相對(duì)獨(dú)立的進(jìn)化分支，雖然ADV與MEV、CMV、MVM分支相對(duì)親緣關(guān)系較近，但在進(jìn)化關(guān)系上明顯屬于不同的分支。根據(jù)ICTV8新的分類標(biāo)準(zhǔn)，ADV被劃歸為新的病毒屬，與其他4個(gè)屬并列，本試驗(yàn)的進(jìn)化樹分析結(jié)果與新分類標(biāo)準(zhǔn)吻合。

表3 細(xì)小病毒參考株列表Table 3 Lists of reference parvovirus strains used in this study

2.4 ADV毒株VP2蛋白氨基酸序列分析

通過DNA Star軟件對(duì)5株ADV的VP2核苷酸推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比分析（圖4）可知，所分離的5株毒株中，61個(gè)氨基酸發(fā)生突變。在這61個(gè)氨基酸中，有2個(gè)突變位點(diǎn)僅存在于此次分離的毒株中，即115位亮氨酸和362位谷氨酸。

3 討論

雖然ADV發(fā)現(xiàn)較早，但我國(guó)對(duì)于完整編碼區(qū)基因的報(bào)道較少，因此對(duì)我國(guó)貂場(chǎng)ADV流行株的基因背景尚不清楚。對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離的5株阿留申病毒進(jìn)行全基因測(cè)序，獲得5個(gè)分離株的全基因序列。與GenBank中其他ADV毒株核苷酸序列比較分析，5個(gè)ADV分離株與歐美毒株ADV-G、ADVUtahl、ADV-SL3的核苷酸同源性最低的為92.8%，最高的為97.6%，差距較大，這與其他學(xué)者的報(bào)道一致［9-10］。通過DNA Star軟件對(duì)5個(gè) ADV的 VP2核苷酸推導(dǎo)的氨基酸序列分析可知，所分離的5個(gè)毒株中，61個(gè)氨基酸發(fā)生突變。在這61個(gè)氨基酸中，有2個(gè)突變位點(diǎn)僅存在于此次分離的毒株中，即115位亮氨酸和362位谷氨酸。特殊位點(diǎn)位于G／U-8上的翻譯核衣殼VP2蛋白的352位氨基酸［11］與534位點(diǎn)的組氨酸［12］，5個(gè)分離毒株均與AD VUtah 1株相同，分別為蘇氨酸和天冬氨酸。ADVDL124和ADV-DL125與ADV-G株相同，在26-35氨基酸處缺失9個(gè)氨基酸，且在36氨基酸處缺失一個(gè)氨基酸-甘氨酸。ADV-Q2在541-636位的氨基酸與其他毒株差異較大，但動(dòng)物回歸試驗(yàn)可知，該毒株同樣可以引起水貂發(fā)病，是致病毒株。這些特殊位點(diǎn)的氨基酸的突變和缺失對(duì)貂阿留申病毒功能的影響還有待進(jìn)一步研究。

圖3 ADV病毒與細(xì)小病毒亞科其他屬代表毒株的進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of ADV isolates in this study and the representative strains of other genera in subfamily Parvovirinae.

圖4 試驗(yàn)株VP2蛋白與參考株的氨基酸序列分析部分結(jié)果Fig 4.The comparison of the amino acid sequences of VP2of ADV isolates and the reference strains

從本試驗(yàn)所構(gòu)建的ADV分離毒株全長(zhǎng)基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中可知，分離株ADV-DL124和ADVDL125與國(guó)外參考株ADV-G、ADV-Utah和ADVSL3位于不同的進(jìn)化分支，親緣關(guān)系上相對(duì)較遠(yuǎn)，分析可能原因?yàn)閲?guó)內(nèi)分離株為本試驗(yàn)選取的參考株以外的其他國(guó)外毒株進(jìn)化而來(lái)或者相對(duì)于國(guó)外參考株來(lái)說發(fā)生了基因的變異。無(wú)論是出于哪種原因，本研究中用到的ADV分離株具有高度的遺傳多樣性，這與國(guó)外學(xué)者得到的ADV具有高度遺傳多樣性的研究結(jié)論相一致［8］。在研究中，無(wú)論是基于VP2基因序列的研究，還是基于對(duì)NS-1基因序列的研究，ADV存在高度遺傳多樣性的現(xiàn)象均得到了證明。

病毒通過變異產(chǎn)生的遺傳多樣性及對(duì)變化莫測(cè)的環(huán)境的驚人適應(yīng)能力構(gòu)成了病毒的生存和進(jìn)化的基礎(chǔ)。高度遺傳多樣性的存在，在某種程度上也意味著遺傳、變異趨勢(shì)的不穩(wěn)定性。因此，積極應(yīng)對(duì)病毒的進(jìn)化，密切關(guān)注ADV遺傳進(jìn)化的規(guī)律和趨勢(shì)，為進(jìn)一步進(jìn)行診斷和預(yù)防阿留申病毒的研究積累基礎(chǔ)資料顯得尤為必要。本試驗(yàn)通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室所分離的具有致病性的5株水貂阿留申病毒全基因測(cè)序分析，可以發(fā)現(xiàn)，分離株之間存在著諸多的差異，這些差異對(duì)病毒的功能和本身致病性的影響，還需進(jìn)一步研究。同時(shí)，這些位點(diǎn)的差異，為研制水貂阿留申病基因疫苗提供了理論依據(jù)，為基因改造水貂阿留申病疫苗提供了探索和嘗試的方向。

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