趙 劼，王永紅，儲 炬，張嗣良，莊英萍

（華東理工大學(xué) 生物工程學(xué)院，上海 200237）

丙酮酸氧化酶（EC1.2.3.3）是一種十分重要的醫(yī)用試劑酶.在PO4-3和O2存在條件下，它能夠催化丙酮酸脫羧產(chǎn)生H2O2，CO2和乙酰磷酸[1].在過氧化物酶的共同作用下，丙酮酸氧化酶可以用于人體血液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的測定[2]，同時，還可用于河水和廢水[3]中磷酸根離子含量的測定.然而，商品化的PyOD幾乎都來源于野生型的植物乳桿菌和綠色氣球菌，發(fā)酵單位最高僅為120 U/L[4-6].大腸桿菌是一種通用的外源蛋白表達(dá)載體，迄今為止，重組大腸桿菌已經(jīng)成功應(yīng)用于許多醫(yī)用蛋白[7-9]的外源表達(dá).在以前的研究中，對重組大腸桿菌DH5α/pSMLPyOD異源表達(dá)PyOD做了初步優(yōu)化，使得發(fā)酵單位提高到了670 U/L[10].然而，在重組大腸桿菌的發(fā)酵過程中，質(zhì)粒不穩(wěn)定性（Plasmid instability）是一個比較嚴(yán)重的問題，會導(dǎo)致目的產(chǎn)物水平的下降.在工業(yè)發(fā)酵過程中，對重組細(xì)胞要求質(zhì)粒穩(wěn)定性保持在25代以上[11].因此，研究重組細(xì)胞質(zhì)粒的穩(wěn)定性對于提高發(fā)酵效率有著十分重要的意義[12].從目前已有報道來看，影響質(zhì)粒穩(wěn)定性的因素很多，比如生長培養(yǎng)基組分[13-14]、質(zhì)?？截悢?shù)[15]、宿主遺傳背景、培養(yǎng)條件、比生長速率[16]、培養(yǎng)溫度[17]、外源蛋白表達(dá)水平[18]以及所表達(dá)蛋白的毒性等[19].本文從碳源、培養(yǎng)溫度、溶氧，pH值以及外源蛋白表達(dá)等因素對重組大腸桿菌DH5α/pSMLPyOD搖瓶發(fā)酵過程質(zhì)粒穩(wěn)定性進(jìn)行研究.

1 材料與方法

1.1 材料

重組大腸桿菌DH5α/pSMLPyOD由本實驗室構(gòu)建，丙酮酸氧化酶基因克隆自Aerococcus viridans ATCC10400（AvPyOD）.重組大腸桿菌DH5α/pSMLPyOD能夠組成型表達(dá)丙酮酸氧化酶.

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒穩(wěn)定性測定

參照Zhang等[12]方法進(jìn)行.

1.2.2 菌體生物量測定

菌體生長量以600 nm處光密度（OD600）表示.

1.2.3 丙酮酸氧化酶活性測定

參照Zhao等[10]方法測定丙酮酸氧化酶活性.

1.2.4 碳源對發(fā)酵過程中質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響

保持培養(yǎng)基中其他組分不變，分別以1%的葡萄糖，甘油和糊精為碳源，考察不同碳源條件下，發(fā)酵過程中菌體生長，質(zhì)粒穩(wěn)定性及產(chǎn)酶情況.

1.2.5 溫度對發(fā)酵過程中質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響

選擇28，32，37℃三個不同溫度進(jìn)行發(fā)酵，研究發(fā)酵溫度對重組大腸桿菌DH5α/pSMLPyOD發(fā)酵過程中菌體生長，質(zhì)粒穩(wěn)定性及產(chǎn)酶的影響.

1.2.6 溶氧對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響

采用不同裝液量法，250 ml三角瓶分別盛裝30，60，90 ml培養(yǎng)基，同等條件培養(yǎng)，考察溶氧對工程菌生長，產(chǎn)酶，質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響.

1.2.7 發(fā)酵過程pH值對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響

采用pH搖床，控制培養(yǎng)過程中搖瓶pH值為6，6.5，7，7.5，以研究不同pH培養(yǎng)條件對工程菌生長，產(chǎn)酶，質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響.

1.2.8 外源蛋白表達(dá)對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響

重組質(zhì)粒pSMLPyOD轉(zhuǎn)入空載大腸桿菌JM109（recA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thi△（lac-proAB）F traD36proAB，lacIqlacZ△M15），得到重組大腸桿菌JM109/pSMLPyOD，該重組菌為誘導(dǎo)型表達(dá).將JM109/pSMLPyOD與DH5α/pSMLPyOD在37℃同等條件下培養(yǎng)，以考察外源丙酮酸氧化酶表達(dá)對質(zhì)粒pSMLPyOD穩(wěn)定性的影響.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源對E.coli DH5α/pSMLPyOD發(fā)酵過程中質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響

圖1 不同碳源條件下DH5α/pSMLPyOD發(fā)酵過程中質(zhì)粒穩(wěn)定性

在無抗生素選擇性壓力條件下，碳源對重組大腸桿菌DH5α/pSMLPyOD搖瓶發(fā)酵過程中的質(zhì)粒穩(wěn)定性影響較大.當(dāng)以葡萄糖為碳源時，質(zhì)粒穩(wěn)定性最差，發(fā)酵終點時，質(zhì)粒穩(wěn)定性僅有11%左右，而且菌體生長及產(chǎn)酶處于較低水平，分別 為 光 密 度OD600nm為4.8和88 U/L.而以甘油為碳源時，重組菌在整個發(fā)酵過程中一直保持著較高的質(zhì)粒穩(wěn)定性，發(fā)酵終了時，質(zhì)粒穩(wěn)定性仍高達(dá)88%，光密度 OD600nm為 18，酶產(chǎn)量700 U/L，遠(yuǎn)高于葡萄糖和糊精（見圖1a，1b，1c）. 黃華等[20]在利用重組大腸桿菌DH5a/AfPGA發(fā)酵表達(dá)青霉素G?；傅难芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)，葡萄糖為碳源時，質(zhì)粒穩(wěn)定性較差，XU Zhi-nan等[21]在研究培養(yǎng)基組分對質(zhì)粒DNA復(fù)制的影響中也發(fā)現(xiàn)，以甘油為碳源時，宿主大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒產(chǎn)量最高.

從pH值變化情況可以看出（圖1d），當(dāng)以葡萄糖為碳源時，過程pH值下降很快，最低pH值僅有4.5左右.而以甘油為碳源時，過程pH值始終穩(wěn)定在6.5左右，這可能與重組菌對不同碳源的代謝速率不同有關(guān).從碳流平衡角度看，流入細(xì)胞的碳流應(yīng)相當(dāng)于細(xì)胞用于生物合成和產(chǎn)生能量的碳流，但當(dāng)碳流超過主要代謝途徑的容量時，代謝發(fā)生不平衡，就可能通過形成代謝副產(chǎn)物乙酸來實現(xiàn)代謝平衡.葡萄糖作為碳源，其吸收速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他碳源，代謝失衡極易發(fā)生[22]，從而產(chǎn)生乙酸并分泌到發(fā)酵體系中，當(dāng)乙酸積累到一定程度，就會抑制菌體生長[23]，無質(zhì)粒細(xì)胞由于其代謝壓力較輕，因而對乙酸的耐受性可能要高于帶質(zhì)粒細(xì)胞.如果以甘油作為碳源，則可以顯著降低乙酸產(chǎn)量或者不產(chǎn)生乙酸，與葡萄糖相比，細(xì)胞吸收甘油的速率較低，所以進(jìn)入糖酵解的碳流下降，從而大大減少了乙酸的生成.當(dāng)以糊精為碳源時，由于其為慢利用碳源，重組細(xì)胞必須先將其水解為葡萄糖，培養(yǎng)體系呈碳源限制性狀態(tài)，菌體生長明顯受到抑制，另外，由于細(xì)胞可能會利用培養(yǎng)基中的蛋白胨和酵母粉為碳源，因而造成培養(yǎng)體系pH值過高，達(dá)7.5以上.

2.2 不同培養(yǎng)溫度對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響

不同培養(yǎng)溫度下，重組大腸桿菌DH5α/pSML?PyOD質(zhì)粒穩(wěn)定性情況如圖2所示.37℃條件下，質(zhì)粒pSMLPyOD穩(wěn)定性最好，14 h發(fā)酵終了時依然保持在85%以上，而28℃和32℃條件下，盡管菌體生長速率較慢（圖2b），但質(zhì)粒穩(wěn)定性也較低.這與Gupta等[17]在研究質(zhì)粒pCPPS-31在大腸桿菌DH5α中的穩(wěn)定性時得到的結(jié)果基本一致.Oscam[24]等在研究質(zhì)粒pTB13在枯草芽孢桿菌中的穩(wěn)定性時也發(fā)現(xiàn)，較高培養(yǎng)溫度下質(zhì)粒更穩(wěn)定，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在較高培養(yǎng)溫度下宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒拷貝數(shù)也較高.低溫盡管能夠控制宿主的比生長速率，但低溫對質(zhì)粒的復(fù)制也有抑制作用，低溫也可能不利于質(zhì)粒在細(xì)胞間的分配.但對于不同的宿主菌和質(zhì)粒來說，溫度對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響不盡相同，據(jù)K wang等[25]報道，Bacil?lus megateriu/pCKI08在低溫30℃條件下培養(yǎng)質(zhì)粒最穩(wěn)定.

圖2 不同培養(yǎng)溫度下DH5α/pSMLPyOD發(fā)酵過程中質(zhì)粒穩(wěn)定性

盡管低溫條件下重組大腸桿菌DH5α/pSMLPyOD的質(zhì)粒穩(wěn)定性較差，但從圖2c可以看出，工程菌的產(chǎn)酶水平并沒有降低，36 h發(fā)酵終了時，32℃條件下PyOD水平高達(dá)1078 U/L，而37℃條件下PyOD水平在14 h達(dá)到最高，僅為930 U/L.低溫條件下有利于重組大腸桿菌中外源蛋白的表達(dá)[26]，但影響機(jī)理比較復(fù)雜，據(jù)Corisdeo等[27]報道，低溫有利于外源基因mRNA的翻譯，也有報道認(rèn)為，溫度會影響外源蛋白的分泌及胞內(nèi)蛋白酶的活性[28].

2.3 溶氧水平對重組大腸桿菌DH5α/pSMLPyOD發(fā)酵過程中質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響

溶氧是發(fā)酵過程中影響重組菌生長及質(zhì)粒穩(wěn)定性的又一因素，富氧能維持較高的比生長速率，但氧氣對好氧微生物有著潛在的毒性副作用；低溶氧水平有時對生產(chǎn)有利，但過低的溶氧會導(dǎo)致乙酸的大量生成，菌體生長受到抑制，比生長速率下降，而比生長速率過高或過低都可能影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性[29].通過改變培養(yǎng)基在搖瓶中的裝液量以研究不同溶氧水平對重組大腸桿菌DH5α/pSMLPyOD質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響.結(jié)果表明（見圖3），溶氧對菌體生長是有影響的，裝液量越小，菌體比生長速率越高，當(dāng)裝液量為30 mL時，最大比生長速率達(dá)0.26 h-1，而裝液量為60和90 mL時，最大比生長速率分別為0.22 h-1和0.17 h-1，質(zhì)粒穩(wěn)定性也隨裝液量的變化而變化，在裝液量為30和60 mL時，質(zhì)粒穩(wěn)定性均保持較高水平，其中以60 mL裝液量最高，發(fā)酵14 h時仍保持在88%左右，但可以看出，在各裝液量條件下，細(xì)胞質(zhì)粒均保持了較高的穩(wěn)定性.

有關(guān)溶氧對質(zhì)粒穩(wěn)定性影響的報道較多，但對其機(jī)理目前還不清楚.Huang等[30]的研究表明，質(zhì)粒穩(wěn)定性與比生長速率無關(guān)，溶氧過高或過低都會引起質(zhì)粒的丟失[31].研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒穩(wěn)定性與比生長速率是相關(guān)的，在較低搖床轉(zhuǎn)速下，質(zhì)粒穩(wěn)定性和比生長速率隨攪拌轉(zhuǎn)速的提高而同時提高，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速達(dá)到100 rpm時，比生長速率達(dá)到0.52 h-1，此時質(zhì)粒穩(wěn)定性可保持在92%，但當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速提高到250 rpm時，比生長速率達(dá)0.92 h-1，此時質(zhì)粒穩(wěn)定性降至80%左右，因而，控制溶氧的目的就是為了使質(zhì)粒復(fù)制速率與宿主菌生長速率之間的差別最小化.他們還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)搖瓶裝液系數(shù)為0.1時，質(zhì)粒穩(wěn)定性最高，這與我們的實驗結(jié)果基本一致.

2.4 pH水平對重組大腸桿菌DH5α/pSMLPyOD發(fā)酵過程中質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響

利用pH搖床控制過程中pH值分別為6.0，6.5，7.0，7.5，結(jié)果表明（見圖4），在各pH條件下，重組菌質(zhì)粒穩(wěn)定性均較好（85%以上），但在pH7.5條件下，工程菌的生長及產(chǎn)酶均受到抑制.有關(guān)pH值對質(zhì)粒穩(wěn)定性影響的報道并不多見，Marmelstein等[32]在研究Clostridium acetobutylicum的發(fā)酵過程時發(fā)現(xiàn)，低pH條件下質(zhì)粒更加穩(wěn)定，但研究表明，pH值對質(zhì)粒穩(wěn)定性沒有顯著影響，也有報道指出當(dāng)發(fā)酵過程的pH值控制在6.5～7.0之間時，質(zhì)?？截悢?shù)最低[33].

另外，從單位菌體產(chǎn)酶情況來看（見表1），低pH條件有利于酶的表達(dá)，當(dāng)發(fā)酵過程pH水平控制在6.5時，菌體比酶活最高，當(dāng)pH值高于7，菌體產(chǎn)酶水平降低，pH值7.5時，菌體比酶活僅有23 U/L/OD600.

圖3 不同溶氧條件下DH5α/pSMLPyOD發(fā)酵過程中質(zhì)粒穩(wěn)定性

表1 不同pH條件下單位菌體產(chǎn)酶水平/U/L/OD600

圖4 不同pH條件下DH5α/pSMLPyOD發(fā)酵過程中質(zhì)粒穩(wěn)定性

2.5 外源蛋白表達(dá)對重組菌質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響

將重組質(zhì)粒pSMLPyOD轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109，所得到的重組菌JM109/pSMLPyOD為誘導(dǎo)型表達(dá)，將其與重組菌DH5α/pSMLPyOD在同等條件下培養(yǎng)，研究外源丙酮酸氧化酶表達(dá)對質(zhì)粒pSMLPyOD穩(wěn)定性的影響.結(jié)果表明（見圖5），在誘導(dǎo)型重組菌搖瓶發(fā)酵過程中，質(zhì)粒穩(wěn)定性始終保持在高水平，發(fā)酵結(jié)束時仍高達(dá)91%，高于表達(dá)外源蛋白的重組菌DH5α/pSMLPyOD.據(jù)Bentley等[34]研究報道，外源蛋白表達(dá)會給宿主細(xì)胞帶來代謝和生長壓力，這就造成了帶質(zhì)粒細(xì)胞和空載細(xì)胞生長速率的差異，從而引起發(fā)酵過程中質(zhì)粒的丟失.由于JM109/pSMLPyOD不表達(dá)外源丙酮酸氧化酶，帶質(zhì)粒的JM109和空載JM109之間的生長差異較小，因而使得質(zhì)粒穩(wěn)定性保持在較高水平.不過從圖5中也可看出，JM109的生長速率和最終菌體量都遠(yuǎn)小于DH5α/pSMLPyOD，這可能是由于培養(yǎng)基是以后者為對象進(jìn)行優(yōu)化的，因而不適于JM109的生長.

圖5 外源丙酮酸氧化酶表達(dá)對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論

對重組大腸桿菌DH5α/pSMLPyOD搖瓶發(fā)酵過程中質(zhì)粒穩(wěn)定性的研究表明，碳源、溫度、溶氧及外源蛋白表達(dá)對重組大腸桿菌DH5α/pSMLPyOD的質(zhì)粒穩(wěn)定性均有影響.以甘油為碳源，37℃，裝液量10%～15%條件下重組菌質(zhì)粒穩(wěn)定性最好.另外，當(dāng)發(fā)酵過程中體系pH值在6～7之間時，質(zhì)粒穩(wěn)定性較高，但當(dāng)pH值提高至7.5時，質(zhì)粒穩(wěn)定性會有所下降.低pH條件有利于重組菌產(chǎn)丙酮酸氧化酶.外源蛋白表達(dá)使得重組菌質(zhì)粒穩(wěn)定性有所下降.

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