趙瑞華，鄧振山，賀曉龍

(延安大學生命科學學院，陜西延安716000)

陜西地區(qū)煙粉虱生物型的鑒定及其危害分析

趙瑞華，鄧振山，賀曉龍

(延安大學生命科學學院，陜西延安716000)

為探明陜西地區(qū)煙粉虱的危害及主要生物型，實地調(diào)查了陜西地區(qū)主要農(nóng)作物上煙粉虱的危害狀況與發(fā)生程度，并利用mtDNACOI基因測序方法，對陜西地區(qū)煙粉虱的生物型組成進行了分析鑒定。同源性分析結(jié)果表明，B型和Q型煙粉虱是陜西地區(qū)煙粉虱種群的主要生物型，其中B型占所測總樣本的78.85%，表明陜西省煙粉虱主要生物型仍是B型，但Q型種群比例在增長，不排除有取代B型成為陜西地區(qū)煙粉虱主要危害類型的趨勢。在陜西地區(qū)煙粉虱主要危害的植物是茄科的煙草、甜椒、番茄以及葫蘆科的黃瓜、西葫蘆，而十字花科植物普遍受害較輕，茄科的馬鈴薯和豆科的豇豆、豌豆受害最輕。

煙粉虱；生物型；危害；寄主植物

煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)是一種世界性的重要害蟲，食性廣泛，寄主植物多樣。其主要危害蔬菜、棉花、觀賞植物等，并且能夠傳播110多種植物病毒，給許多經(jīng)濟作物造成嚴重的經(jīng)濟損失[1]。煙粉虱是一個正處于快速進化過程的復(fù)合種，由多種不同的生物型構(gòu)成，到2005年為止被賦予特定生物型的種群有26個[2]。不同生物型的煙粉虱在許多方面(如地理分布、寄主范圍、傳毒能力及對農(nóng)藥敏感性等)存在顯著差異。

由于二十世紀末煙粉虱在我國開始爆發(fā)，并且引發(fā)的危害越來越嚴重，我國相關(guān)單位加大了對煙粉虱的研究力度。首先對煙粉虱的發(fā)生危害及生物學特性進行了研究，在此基礎(chǔ)上，也對我國煙粉虱的生物型在分子水平上進行了初步研究鑒定。如利用RAPD-PCR分析研究，將我國10個煙粉虱種群分為3種生物型(包括B型煙粉虱)，通過rDNA-ITS1序列分析，證明B型煙粉虱是我國的入侵生物型[3]。利用mtCOI(cytochrome oxidaseI)基因片段作標記，采用序列分析法對近年來在我國爆發(fā)危害的5個煙粉虱種群的生物型進行鑒定，結(jié)果表明5個種群生物型與Texas-B型和Arizona-B型種群為同一生物型“B”[4]。應(yīng)用mtCOI分子標記證實我國絕大部分地區(qū)煙粉虱為B型，云南、北京地區(qū)存在Q型，浙江、廣東存在非B/Q型煙粉虱[5]。2005年首次報道了于2003年在云南昆明采集的煙粉虱為Q型煙粉虱[6]，隨后在浙江局部地區(qū)、江蘇省的南通和鹽城、北京、河南省也發(fā)現(xiàn)了Q型煙粉虱的存在[7-9]。2003年7月在浙江大學華家池校區(qū)的蔬菜上采集到一個煙粉虱種群，經(jīng)mtDNACOI基因序列分析為非B型煙粉虱，初步認定該種群為中國本地的一種非B生物型，暫時稱為浙江非B型煙粉虱China-ZHJ-1(簡稱ZHJ-1)種群。mtCOI分子標記鑒定結(jié)果顯示，我國至少存在6個煙粉虱單倍型(B、Q、ZHJ-1、ZHJ-2、ZHJ-3和FJ-1)[10]。

近年來，煙粉虱在陜西省迅速由次要害蟲上升為主要害蟲，其危害逐漸引起人們的重視，但還沒有關(guān)于煙粉虱在陜西地區(qū)分布危害及生物型鑒定的比較全面的報道。筆者曾于2009～2011年對全國19個省市5個科的寄主植物共58個煙粉虱地理種群進行過較為系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)Q型煙粉虱發(fā)生頻率逐年升高，但當時陜西地區(qū)只檢測到B型煙粉虱[11]。因此，為了探討不同生物型煙粉虱種群在陜西省不同地區(qū)的發(fā)生現(xiàn)狀，預(yù)測其發(fā)展趨勢，明確陜西省三大生態(tài)區(qū)域主要受害作物上煙粉虱的生物型以及不同生物型煙粉虱的地理分布與主要寄主上發(fā)生程度之間的關(guān)系。我們于2013年煙粉虱發(fā)生危害高峰期在陜西省9個市、20個地點對當?shù)刂饕芎闹魃蠠煼凼陌l(fā)生危害情況進行了抽樣調(diào)查，應(yīng)用危害指數(shù)對不同作物上煙粉虱的發(fā)生危害程度進行了比較，同時通過mtDNACOI分子標記技術(shù)鑒定各地主要受害寄主上煙粉虱生物型，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，以期從宏觀上進一步把握不同生物型煙粉虱在陜西省的區(qū)域性遺傳分布與主要寄主種類，從而為該地區(qū)煙粉虱的綜合治理指導(dǎo)防治提供合理的建議。

1 材料與方法

1.1 采樣及危害程度調(diào)查

2013年6月到9月在煙粉虱發(fā)生高峰期，分別在陜西省6個地區(qū)陜北延安、陜北榆林、關(guān)中寶雞、關(guān)中西安、陜南安康和陜南商洛調(diào)查煙粉虱寄主植物。調(diào)查對象主要是大田作物如蔬菜、煙草等。調(diào)查時輕輕翻轉(zhuǎn)葉片，收集成蟲，用75%乙醇浸泡于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ涗浖闹髦参?，并確定該作物所屬的科、屬、種。

對主要寄主植物上煙粉虱蟲口密度與危害情況的調(diào)查采用5點取樣法。每個點隨機選取10個植株，每個植株再分別選上、中、下三個部位的葉片各3片，把葉片輕輕翻轉(zhuǎn)過來，觀察葉片的背面，記錄煙粉虱成蟲數(shù)。同時采集葉片帶回實驗室，在解剖鏡下觀察統(tǒng)計煙粉虱卵、若蟲和偽蛹的數(shù)量。有些寄主植物葉片比較密集難以區(qū)分上、中、下三部分，則分別選取靠近植株中下部的老葉和上部的嫩葉各3片進行鏡檢，以葉片為單位統(tǒng)計寄主植物上煙粉虱若蟲和偽蛹的數(shù)量，求取平均值作為最終結(jié)果。目前按照國內(nèi)外有關(guān)煙粉虱危害程度的標準，危害等級劃分為4級：1級“+”，代表每個葉片小于10頭；2級“++”，代表每個葉片10～30頭；3級“+++”，代表每個葉片30～50頭；4級“++++”，代表每個葉片大于50頭。同時寄主上發(fā)生危害程度以發(fā)生最嚴重時的樣本記錄危害等級。

1.2 煙粉虱生物型的鑒定與分析

1.2.1 單頭煙粉虱總DNA的提取

從每個采集地點的煙粉虱樣本中隨即選取數(shù)頭個體，參照De Barro和Driver(1997)的方法提取煙粉虱個體總DNA[12]。

1.2.2 PCR反應(yīng)條件

參照羅晨等(2002)的方法，擴增mtDNA COI基因片段采用的引物為C1-J-2195(5′-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3′)和L2-N-3014(5′-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3′)[13]。PCR擴增產(chǎn)物是mtDNACOI3′末端的部分序列，大小約為840 bp。在0.2 mL PCR管中加入50 μL PCR反應(yīng)體系，包含1 μL TaqDNA酶，2 μL DNA模板，2 μL引物C1-J-2195((20 μmol/L)，2μLL2-N-3014((20 μmol/L)，1μL dNTP(10 mmol/L)，5 μL 10×PCRbuffer。反應(yīng)體系于94°C下預(yù)變性4 min；然后進行38個如下循環(huán)：94 ℃變性1 min；50 ℃退火1 min；72 ℃延伸1 min；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸5 min，10 ℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物可置于4 ℃冰箱保存或-20 ℃長期保存。

電泳觀察PCR結(jié)果：瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物。然后在紫外光下切下條帶較亮的目的片段，置于離心管中，進行回收。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的純化及送樣測序

使用OMEGABIO-TEK純化試劑盒對回收的PCR產(chǎn)物進行DNA純化。將純化好的產(chǎn)物連同各5 μL的上下游引物一起交由上海生工進行測序。

1.2.4 序列分析

將上海生工提供的DNA序列在NCBI上與國內(nèi)外代表地區(qū)的煙粉虱COI序列進行比對，如比對結(jié)果顯示同此序列相似性最高的前幾個序列為B型或Q型煙粉虱的話(以相似性在99%-100%為標準)，則可以初步認為此序列所代表的該煙粉虱個體為B型或Q型煙粉虱。隨機選取西安Q型和延安B型的一條測序結(jié)果提交GenBank，序列登錄號分別是：KT235801和KT235802。提取GenBank和文獻中已經(jīng)明確為Q型、B型和其它煙粉虱的mtCOI序列，并將非洲小粉虱Bemsiaafer(Prienser et Hosey)作為外群，利用MEGA5.1軟件，根據(jù)Kimura2-paramter模型，采用鄰位法(NJ)進行聚類分析構(gòu)建系統(tǒng)樹，系統(tǒng)樹各分支置信度(bootstrap)均進行1000次重復(fù)檢驗。系統(tǒng)發(fā)育分析中所用的所有mtCOI序列相關(guān)信息見表2。

2 結(jié)果

2.1 主要寄主危害程度及不同生物型煙粉虱地理分布

通過對陜西地區(qū)主要經(jīng)濟作物種植區(qū)的調(diào)查，共記錄到煙粉虱危害的主要經(jīng)濟作物17種(變種)隸屬4個科，分別為葫蘆科4種、茄科5種、十字花科4種、豆科4種。調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，在陜西地區(qū)煙粉虱主要危害的植物是茄科的煙草、甜椒、番茄以及葫蘆科的黃瓜、西葫蘆，在這些寄主植物的葉片上蟲口密集，植株受害嚴重。普遍受害較輕的是十字花科植物，受害最輕的是茄科的馬鈴薯和豆科的豇豆、豌豆(見表1)。

表1 陜西地區(qū)煙粉虱生物型分布及主要寄主發(fā)生危害程度

通過同源性分析，陜西地區(qū)危害的煙粉虱以入侵型B型的比例最大，為78.85%；入侵型Q型的比例為21.15%，沒有檢測到其它生物型的存在。從不同生態(tài)區(qū)來說，B型煙粉虱的檢出率分別為陜北95.00%、關(guān)中80.49%和陜南69.77%，在陜北B型煙粉虱危害更為嚴重，在陜南Q型煙粉虱危害在加重。從采集寄主上看，B型煙粉虱在所有寄主上都發(fā)生危害，而僅在8個采集點7種寄主上檢測到Q型煙粉虱，其中在葫蘆科和茄科等經(jīng)濟作物上發(fā)生危害比較嚴重，主要對黃瓜和番茄等寄主植物的危害較大。

2.2 生物型檢測及其系統(tǒng)發(fā)育分析

在陜西三個不同生態(tài)區(qū)域的20個采集樣點，共采集了104個樣本，所有樣品測序后均得到840bp左右的片段(見圖1)，分別從每個所測序列中截取720bp的序列進行分析，通過DNAMAN分子生物學分析軟件結(jié)合基因庫序列比對分析發(fā)現(xiàn)，104個煙粉虱樣本的COI基因序列中有82個相同(B型)，其余22個COI基因序列一致(Q型)。

1-4：煙粉虱樣本；M：100 bp DNAMarker

圖1 使用引物C1-J-2195和L2-N-3014對煙粉虱個體進行線粒體COI基因擴增后得到的電泳圖

與已知序列比較(見表2)，構(gòu)建系統(tǒng)樹，進行聚類分析，建樹時以非洲小粉虱(AF418673)為外群，使用鄰位法(NJ)法和非加權(quán)配對算數(shù)平均法(UPGMA)。UPGMA法和NJ法的系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)建結(jié)果相似，所以在此只給出采用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖2)。由構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹可以發(fā)現(xiàn)，非洲小粉虱、A型、B型、Q型不同生物型的煙粉虱遺傳距離較大，均可以明顯的分開。Q-KT235801與已知Q型煙粉虱序列Q-FJ375346(湖北)、Q-EU881713(危地馬拉)、Q-DQ365876(葡萄牙)等的同源性高達100%，顯示Q-KT235801與已知Q型煙粉虱種群聚為同一進化枝，可以確定西安的mtCOI序列所代表的煙粉虱為Q型煙粉虱；B-KT235802與已知B型煙粉虱序列B-AB204577(日本)、B-AJ550170(法國)、B-FJ647211(揚州)等的同源性高達100%，顯示B-KT235802與已知B型煙粉虱種群聚為同一進化枝，可以確定延安的mtCOI序列所代表的煙粉虱為B型煙粉虱。上述序列比對與同源性分析結(jié)果顯示，陜西不同采集樣點的煙粉虱種群同時存在B型和Q型。

表2 系統(tǒng)發(fā)育分析中所涉及的相關(guān)mtCOI序列信息

圖2 基于mtCOI序列的不同生物型煙粉虱的系統(tǒng)發(fā)育分析，外群為非洲小粉虱(AF418673)

3 討論

煙粉虱是由在形態(tài)學上難以區(qū)分并且存在明顯遺傳分化的多個遺傳群組組成的復(fù)合種，根據(jù)其在寄主范圍、傳毒能力和遺傳特性等方面的不同，煙粉虱又被分為至少24種生物型。因此，對煙粉虱生物型的監(jiān)測是煙粉虱綜合治理的基礎(chǔ)，也是優(yōu)化煙粉虱防控策略的一項重要工作。目前在我國至少存在6個煙粉虱單倍型。本世紀初煙粉虱在我國的傳播以B型為主并且逐漸取代白粉虱和當?shù)責煼凼璠14]。此后隨著Q型煙粉虱的入侵，有逐漸取代B型成為優(yōu)勢生物型的趨勢[15]。

本文作者曾于2009～2011年對全國多個煙粉虱地理種群進行過較為系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)在絕大部分地區(qū)Q型煙粉虱發(fā)生頻率逐年升高，但當時陜西只檢測到B型煙粉虱[11]。2013年我們采集了陜西省多個地區(qū)的煙粉虱種群，涉及4科17種寄主植物，可進一步監(jiān)測不同生物型煙粉虱在本地區(qū)的遺傳分布特性和危害程度。從本文的調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，煙粉虱在陜西地區(qū)主要經(jīng)濟作物上的寄主數(shù)量及分布范圍都呈上升趨勢，危害越來越嚴重，已成為該地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的嚴重威脅之一。根據(jù)對陜西地區(qū)煙粉虱mtDNACOI基因序列分析結(jié)果看，陜西地區(qū)發(fā)生的煙粉虱主要為B型，占所測總樣本的78.85%，其分布面積大，危害程度高；Q型煙粉虱在部分寄主上發(fā)生，危害程度也高，說明在陜西地區(qū)Q型煙粉虱發(fā)生頻率加快。同時，試驗結(jié)果還表明，Q型煙粉虱在陜北、關(guān)中和陜南的發(fā)生比例相差較大，陜北最低5%，陜南最高30.23%，說明Q型煙粉虱在陜西地區(qū)的擴散頻率從北到南逐漸加強，并有取代B型煙粉虱的趨勢。這可能與陜西不同地區(qū)的氣候有關(guān)，從陜北到陜南年均溫度逐漸升高，年均溫度影響了Q型煙粉虱對B型煙粉虱的種群替代[11]。在年均溫度比較高的陜南Q型煙粉虱更容易發(fā)生。因此，應(yīng)加強對陜西地區(qū)不同生物型煙粉虱傳播的監(jiān)控。

通過系統(tǒng)聚類樹分析發(fā)現(xiàn)，陜西地區(qū)的B型和Q型煙粉虱分別與國內(nèi)外其他地區(qū)的B型和Q型煙粉虱聚為一支。從對陜西地區(qū)煙粉虱的寄主危害程度的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在葫蘆科和茄科等經(jīng)濟作物上煙粉虱發(fā)生危害比較嚴重，其中B型煙粉虱主要對黃瓜、煙草、甜椒和西葫蘆等寄主植物的危害較大，Q型煙粉虱主要對黃瓜和番茄等寄主植物的危害較大。本文初步明確了陜西地區(qū)煙粉虱的寄主范圍、危害程度及主要生物型，對于合理、準確地進行煙粉虱的危害預(yù)測和綜合治理具有十分重要的意義。

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[責任編輯 李曉霞]

Biotypes Identification and Damage Analysis ofBemisiatabaci(Gennadius) in Shaanxi Area

ZHAO Rui-hua,DENG Zhen-shan,HE Xiao-long

(College of Life Sciences,Yan′an University,Yan′an 716000,China)

To evaluate main biotypes and damage ofBemisiatabaci(Gennadius)in Shaanxi area,we analyzed the extent of damage through investigation and identified the variety of biotypes in Shaanxi main host plants by mtDNA COI sequences ofBemisiatabaci.The sequence analysis results indicated that the B and Q biotypesB.tabacico-existed in Shaanxi area,and B biotypeB.tabaciwas 78.85%.The results showed that B biotype still was the main biotype,but Q biotype spreads widely in Shaanxi area and may replace B biotype as a major crop pest in Shaanxi area.B.tabacidamaged crops seriously such as tobacco,sweet pepper,tomato of solanaceae and cucumber,pumpkin of cucurbitaceae.But the plants of cruciferae were damaged lightly,and damagous to potato of solanaceae and cowpea, peas of leguminosae were lightest.

Bemisiatabaci; biotype; damage; host plant

2015-09-25

陜西省教育廳專項科研計劃項目(14JK1822)；延安大學博士科研計劃項目(YDBK2013-3)；延安市科學技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2014CGZH-09)；陜西省煙草公司科技專項項目(YAYC-2014-FW-01)

趙瑞華(1978—)，女，山東泰安人，延安大學講師，博士。

S435

A

1004-602X(2015)04-0082-06