劉建英，劉代順，劉振峰，韓冰

(遵義市第一人民醫(yī)院，貴州遵義563000)

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞(如肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥疾病，其特征是可逆的氣流受限。過去的研究主要集中在支氣管哮喘的氣道炎癥。近年大量研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者經(jīng)常出現(xiàn)不可逆或部分不可逆性氣流阻塞及持續(xù)的氣道高反應(yīng)性，即使給予積極的抗炎和擴(kuò)張支氣管治療仍無效，認(rèn)為其原因與長(zhǎng)期氣道慢性炎癥直接或間接引起氣道壁結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，氣道壁的這種結(jié)構(gòu)改變稱為氣道重構(gòu)，被認(rèn)為是除氣道慢性炎癥之外哮喘的另一個(gè)重要特征［1］。2010年6月～2011年12月，本實(shí)驗(yàn)通過探討前列腺素D2(PGD2)對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞TGF-β1/Smads信號(hào)通路的影響，為支氣管哮喘氣道重塑提供分子研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 L-929小鼠肺成纖維細(xì)胞(第四軍醫(yī)大學(xué)提供)，胎牛血清、TGF-β2細(xì)胞因子、PGD2受體抑制劑Laropiprant(均購買于 Gibco公司，USA)，TRIzol、PCR試劑盒(均購買于大連寶生物公司)，多克隆兔 TGF-β1抗、多克隆兔 Smad3抗、多克隆兔Smad4抗(美國(guó)CsT公司)，單克隆鼠β-actin(碧云天)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗、HRP標(biāo)記的兔抗鼠二抗、BCA蛋白定量試劑盒、PVDF膜、彩色預(yù)染蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(均購于碧云天)，瓊脂糖(Biowest公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力 參照中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T1688615-1997“醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第五部分:細(xì)胞毒性試驗(yàn)體外法”進(jìn)行。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的L-929細(xì)胞于實(shí)驗(yàn)前1 d傳代，第2天用0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，用10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞為2×105/mL，鋪于96孔平底板中37℃、5%CO2孵箱中孵育4 h，待細(xì)胞貼壁后，即將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞按照時(shí)間梯度分為12 h組、24 h組、48 h 組、72 h、96 h 組，分別用 10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋Laropiprant(稀釋濃度為 0.3、1、3、10、30 μmol/mL)，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，每孔加入100 μL試液，每個(gè)稀釋度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2孵箱中孵育24 h，加入5 mg/mL MTT 20 μL/孔(每毫升 PBS 中溶解 5 mg MTT，經(jīng)0.22 μL濾膜濾過以除菌和去不溶物質(zhì)，低溫、避光保存)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后，用預(yù)溫的PBS清洗2遍，棄去上清，加入溶解液DMSO 100 μL/孔，于微型振蕩器上振蕩5 min，使結(jié)晶物充分溶解，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定各孔吸光度(OD)值。根據(jù)測(cè)定的OD值計(jì)算其相對(duì)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。抑制率=［(對(duì)照組OD值-給藥組OD值)/對(duì)照組OD值］×100%。

1.2.2 RT-PCR 法檢測(cè) TGF-β1、Smad3、Smad4 的mRNA 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L-929細(xì)胞以5×104/mL接種于25 mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，接種24 h，按Laropiprant濃度梯度將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、0 μmol/mL 組、0.3 μmol/mL 組、1 μmol/mL 組、3 μmol/mL 組、10 μmol/mL組，除空白對(duì)照組外，每組分別加入2.5 ng/mL TGF-β2，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，用 TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)進(jìn)行PCR。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:10×RNA PCR buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，Oligo dT 50 pmol，Rnasin 20 U，逆轉(zhuǎn)錄酶 5 U，cDNA 10 μL，補(bǔ)加 DEPC 處理水至 20 μL。于熱循環(huán)儀中95℃預(yù)變性5 min，再進(jìn)行95℃變性1 min、57℃退火1 min、72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。最后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行溴化乙錠染色，并通過2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察。用凝膠圖像分析系統(tǒng)采集圖像。LABWORKS分析軟件對(duì)擴(kuò)充基因的電泳條帶進(jìn)行灰度分析。光密度表示為實(shí)驗(yàn)值/β-actin，分別進(jìn)行3次取平均值。各檢測(cè)指標(biāo)引物序列:TGF-β1:上游 5'-CGGAATTCATGGTCCACAGCATTCCGCTG-3'，下游5'-CGGGATCCCTAATTGATCCCGCTGCTCA-3';Smad3:上游 5'-TGAACACCAAGTGCATTACCA-3'，下游5'-GGAGGTAGAACTGGCGTCTCT-3';Smad4:上游5'-ACATTGGATGGACGACTTCAG-3'，下游 5'-TCAATTCCAGGTGAGACAACC-3'。

1.2.3 Western blotting 法 檢 測(cè) TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白表達(dá)量 按Laropiprant濃度梯度將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、0 μmol/mL 組、0.3 μmol/mL 組、1 μmol/mL組、3 μmol/mL組，除空白對(duì)照組外每組分別加入2.5 ng/mL TGF-β2，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。提取總蛋白，BCA法測(cè)定濃度。以每孔40 mg上樣，用10%的聚丙烯酸胺凝膠電泳分離蛋白，半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，稀釋多克隆兔 TGF-β1抗(1∶500)、多克隆兔Smad3 抗(1∶500)、多克隆兔 Smad4 抗(1∶500)，單克隆鼠β-actin(1∶500)4℃孵育過夜，洗膜后，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000)、HRP標(biāo)記的兔抗鼠二抗(1∶1 000)孵育6 h，用發(fā)光試劑盒顯示蛋白條帶，使用Gensnap凝膠成像系統(tǒng)拍照。光密度=實(shí)驗(yàn)值/βactin，分別進(jìn)行3次取平均值。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 Laropiprant對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞活力的影響細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨Laropiprant濃度增高和作用時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，Laropiprant在濃度達(dá)到1 μmol/mL，作用時(shí)間為24～96 h時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯提高(見圖1)。

圖1 Laropiprant對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞活力的影響

2.2 PGD2對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞 TGF-β1的影響 如圖2A、2B所示，當(dāng)加入PGD2刺激劑TGF-β2后在小鼠成纖維細(xì)胞中TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá)增加;但加入Laropiprant后，隨著其濃度增加，細(xì)胞TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá)逐漸降低，與 Laropiprant 0 μmol/mL 組相比，Laropiprant 1、3、10 μmol/mL 組TGF-β1mRNA 及蛋白降低(P 均 ＜0.05)。

圖2 PGD2對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞TGF-β1的影響

2.3 PGD2對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞Smad3的影響 如圖3A、3B所示，當(dāng)加入TGF-β2后，小鼠肺成纖維細(xì)胞Smad3 mRNA及蛋白表達(dá)增加，但加入Laropiprant后，隨著其濃度增加，細(xì)胞Smad3 mRNA及蛋白表達(dá)逐漸降低，與 Laropiprant 0 μmol/mL組相比，Laropiprant對(duì)Smad3 mRNA及蛋白的抑制在Laropipratnt 0.3、3 μmol/mL 組增強(qiáng)(P 均 ＜0.05)。

圖3 PGD2對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞Smad3的影響

2.4 PGD2對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞Smad4的影響如圖4A、4B所示，當(dāng)加入TGF-β2后，小鼠肺成纖維細(xì)胞Smad4 mRNA及蛋白表達(dá)增加，但加入Laropiprant后，隨著其濃度增加，細(xì)胞Smad4 mRNA及蛋白表達(dá)逐漸降低，與Laropiprant 0 μmol/mL組相比，Laropiprant對(duì)Smad4 mRNA及蛋白的抑制在Laropiprant 3、10 μmol/mL 組增強(qiáng)(P 均 ＜0.05)。

3 討論

近年來，支氣管哮喘氣道重構(gòu)越來越受到重視，但引起和加重哮喘氣道重構(gòu)的因素還不完全了解。目前研究表明，PGD2對(duì)哮喘免疫反應(yīng)起著雙向調(diào)控作用，可作為炎癥介質(zhì)產(chǎn)生致炎作用。Song等［2］在支氣管哮喘患者吸入塵螨后，對(duì)其支氣管肺泡灌洗液進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中的PGD2濃度可增加15倍。PGD2不僅誘導(dǎo)了支氣管收縮，并且促使支氣管收縮的效應(yīng)強(qiáng)于組胺30倍。在支氣管哮喘患者受到抗原的刺激后，其氣道內(nèi)存在大量PGD2。Sedej等［3］通過培養(yǎng)人胎兒肺成纖維細(xì)胞(HFL-1)進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，證明了PGD2不僅抑制HFL-1對(duì)人纖連蛋白起趨化作用的因子，而且還可以減緩成纖維細(xì)胞的遷移，主要是通過Ca2+依賴的蛋白激酶A信號(hào)通路來發(fā)揮作用。在氣道炎癥損傷后修復(fù)過程中，成纖維細(xì)胞太少不利于損傷的修復(fù)，而成纖維細(xì)胞過多則會(huì)使組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使氣道相應(yīng)功能喪失。

圖4 PGD2對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞Smad4的影響

Murata 等［4］的研究表明，TGF-β1在氣道炎癥和纖維化中發(fā)揮了重要作用，其是刺激成纖維細(xì)胞增殖及膠原分泌的主要細(xì)胞因子。有學(xué)者在支氣管哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)TGF-β1水平顯著高于健康對(duì)照組，變應(yīng)原刺激24 h后的TGF-β1水平更高;同時(shí)采用原位雜交和免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)患者的哮喘氣道黏膜，發(fā)現(xiàn)其TGF-β1表達(dá)顯著增加和免疫反應(yīng)顯著增強(qiáng)，增加的量和疾病的嚴(yán)重程度直接相關(guān)。Schwartz等［5］在研究PGD2/DP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)支氣管哮喘發(fā)生的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，PGD2/DP信號(hào)不僅能抑制成纖維細(xì)胞的遷移，也可以調(diào)整成纖維細(xì)胞介導(dǎo)前膠原纖維的收縮反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)以小鼠肺成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，通過應(yīng)用PGD2特異性刺激劑TGF-β2刺激細(xì)胞，運(yùn)用RT-PCR和Western blotting來檢測(cè) TGF-β1、Smad3、Smad4 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著刺激劑 TGF-β2的濃度增加，細(xì)胞TGF-β1、Smad3、Smad4 的表達(dá)升高;但加入 Laropiprant后，隨著其濃度增加，細(xì)胞 TGF-β1、Smad3、Smad4 mRNA及蛋白表達(dá)逐漸降低;與Laropiprant 0 μmol/mL組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示在小鼠氣道慢性炎癥過程中，PGD2可能對(duì)細(xì)胞TGF-β1、Smad3、Smad4的表達(dá)具有調(diào)控作用，這種機(jī)制在慢性氣道炎癥引起的氣道重構(gòu)中可能發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。但是本實(shí)驗(yàn)仍未涉及其具體調(diào)控機(jī)制的研究，此外，在活體復(fù)雜環(huán)境下，PGD2對(duì) TGF-β1/Smads的調(diào)控規(guī)律也有待進(jìn)一步研究。

［1］Nagashima H，Nakamura Y，Kanno H，et al.Effect of genetic variation of IL-13 on airway remodeling in bronchial asthm［J］.Allergol Int，2011，60(3):291-298.

［2］Song WL，Stubbe J，Ricciotti E，et al.Niacin and biosynthesis of PGD2by platelet COX-1 in mice and humans［J］.J Clin Invest，2012，112(4):1459-1468.

［3］Sedej M，Schr?der R，Bell K，et al.D-type prostanoid receptor enhances the signaling of chemoattractant receptor-homologous molecule expressed on T(H)2cells［J］.J Allergy Clin Immunol，2012，129(2):492-500.

［4］Murata T，Aritake K，Tsubosaka Y，et al.Anti-inflammatory role of PGD2in acute lung inflammation and therapeutic application of its signal enhancement［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110(13):5205-5210.

［5］Schwartz JI，Liu F，Wang YH，et al.Effect of laropiprant，a PGD2receptor 1 antagonist，on estradiol and norgestimate pharmacokinetics after oral contraceptive administration in women［J］.Am J Ther，2009，16(6):487-495.