楊如會，劉并進

(麗水學院醫(yī)學院，浙江麗水323000)

西紅花酸是西紅花的主要有效成分，可從茜草科植物梔子果實中提?。?］。前期動物實驗結(jié)果顯示，其可抑制炎癥性疾病核因子-κB(NF-κB)途徑的激活［2，3］;進一步的研究顯示，西紅花酸可以通過抑制蛋白激酶C-θ的磷酸化PKCθ從而抑制NF-κB上游通路中IKKβ的激活［4］。Toll樣受體(TLRs)是機體細胞免疫中的關鍵受體，在天然免疫和獲得性免疫中起著核心作用［5］。TLR4是 TLRs家族中的重要亞型，除了可以識別微生物等外源性物質(zhì)外，還可作為內(nèi)源性物質(zhì)的信號傳導途徑。在TLR4信號傳遞途徑上，一條是通過翻譯起始區(qū)結(jié)構(gòu)域招募接頭分子MyD88對信號通路進行傳導［6］。另一條是通過招募接頭蛋白TRIF進行信號傳遞［7］。2013年4月～2014年2月，我們采用TLR4配體LPS刺激RAW264.7巨噬細胞，同時用西紅花酸和 MyD88 siRNA進行干預，以期探討西紅花酸對巨噬細胞TLR4/NF-κB信號途徑的作用是否通過MyD88信號通路實現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料 藥品和試劑:西紅花酸:磚紅色粉末，由中國藥科大學藥理實驗室精制(含量≥98%，HPLC)，實驗時以二甲基亞砜(DMSO)溶解，再以PBS稀釋成所需濃度，DMSO的終濃度不超過0.01%(v/v);RAW264.7細胞株:中科院上海細胞庫;LPS、zymosan A:Sigma 公司;MyD88、p-JNK、NF-κB/p65 和 GADPH一抗:abcam公司;TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒:Uscnk公司;轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000:Invitrogen公司。小鼠MyD88基因特異性siRNA由上海吉瑪制藥公司根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中MyD88(NM_010851.2)分別設計3條針對MyD88基因的3條siRNA，分別為:sr-1正義5'-GACUGAUUCCUAUUAAAUA-3'，反義 5'-UAUUUAAUAGGAAUCAGUC-3';sr-2正義5'-CGUUCUCUACCAUAGAGGC-3'，反義 5'-GCCUCUAUGGUAGAGAACGC-3';sr-3:正義 5'-GCAUUUUAAAGCAACCUGG-3'，反義5'-CCAGGUUGCUUUAAAAUGC-3';陰性對照為無義序列NC siRNA。

1.2 MyD88 siRNA轉(zhuǎn)染及最佳siRNA的確定RAW264.7巨噬細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(含100 IU/mL青霉素和100 IU/mL鏈霉素)在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長情況，每隔2～3 d換液1次。細胞轉(zhuǎn)染方法:將4條MyD88 siRNA分別和轉(zhuǎn)染試劑按照說明書中的比例混合，加入細胞培養(yǎng)皿中，24 h后提取各基因和蛋白，RT-PCR和Western blotting法確定出最佳siRNA。

1.3 分組 MyD88 siRNA轉(zhuǎn)染24 h后換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h進行實驗分組:NC siRNA轉(zhuǎn)染組(A 組)、空白對照組(B 組)、LPS 500 μg/L 組(C組)、LPS 500 μg/L+西紅花酸(10－5mol/L)+MyD88 siRNA轉(zhuǎn)染組(D 組)，LPS 500 μg/L+西紅花酸(10－5mol/L)組(E組)。每組設6個平行復孔，按上述條件分別處理24 h后提取蛋白和基因備用。

1.4 RAW264.7 巨噬細胞 IL-6、MCP-1、TNF-α、IFN-β和iNOS mRNA的檢測 采用RT-PCR法。根據(jù) GeneBank 基因序列設計 IL-6、MCP-1、TNF-α、IFN-β、iNOS mRNA引物序列，由上海生工生物工程公司合成，引物序列如下:MyD88:5'-CTATCACCTCCAGGTTTCTA-3'，5'-GAAGACATTGAGCCACCTTA-3'，299 bp;IL-6:5'-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3'，5'-GCCACTCCTTCTGTGACTCC-3'，521bp;TNF-α:5'-ACGGCA-TGGATCTCAAAGAC-3'，5'-GGTCACTGTCCCAGCATCTT-3'，550 bp;iNOS:5'-GTGGTGACAAGCACATTTGG-3'，5'-GGCTGGACTTTTCACTCTGC-3'，487 bp;MCP-1:5'-TGAGGTGGTTGTGGAAAAGG-3'，5'-CCTGCTGTTCACAGTTGCC-3'，382 bp;IFN-β:5'-AGCAGCTGAATGGAAAGATCAAC-3'，5'-GGATGGCAAAGGCAGTGTAAC-3'，124 bp;GAPDH:5'-TGCTCGAGATGTCATGAAGG-3'，5'-TTGCGCTCATCTTAGGCTTT-3'，522 bp。收集各組處理后細胞，用TRIzol提取總RNA，紫外分光光度計測定核酸的濃度和純度，轉(zhuǎn)錄成cDNA，BIO-RAD PCR儀進行基因擴增，PCR 反應條件:94 ℃、5 min，94 ℃、45 s，55 ℃、40 s，72℃、60 s，然后第2～4個步驟進行30個循環(huán)，最后72℃、5 min，反應結(jié)束后4℃保存，收集擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳分析。對PCR反應產(chǎn)物進行1.0%(w/v)瓊脂糖凝膠100 VA電泳45 min，用凝膠圖像分析系統(tǒng)采集圖像。圖像分析:Quantity One v4.62 Software分析軟件對擴充基因的電泳條帶進行灰度分析，以目的條帶的光密度值與相應的GADPH條帶的光密度值進行比較。

1.5 RAW264.7 巨噬細胞 NF-κB/p65、p-JNK 蛋白的檢測 提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白定量，制備10%聚丙烯酰胺凝膠，進行SDS-PAGE電泳，并實施PVDF轉(zhuǎn)膜，Western blotting法檢測p-JNK、NF-κB/p65 和 GADPH 蛋 白 表 達，采 用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進行分析，蛋白表達量用光密度值表示，以GADPH作為內(nèi)參對照。

1.6 RAW264.7細胞培養(yǎng)液中 TNF-α 和 IL-6的水平的檢測 采用ELISA法。收集不同方法處理的RAW264.7細胞的上清液，按ELISA試劑盒說明操作，每組設6個復孔，檢測細胞因子TNF-α和IL-6水平。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，兩組比較采用配對t檢驗，總體差異顯著性分析采用方差分析(one-way AVONA)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組 TNF-α、MCP-1、iNOS、IL-6、IFN-β mRNA比較 見表1。

2.2 各組 p-JNK、NF-κB/p65 蛋白表達及 TNF-α、IL-6水平比較 見表2。

3 討論

巨噬細胞表面TLR4屬于TLRs家族重要模式識別受體，作為炎癥信號傳遞門戶蛋白，能夠識別特定類型微生物的保守分子成分，從而激活信號轉(zhuǎn)導途徑，誘導炎癥反應;還參與機體細胞增殖與分化以及炎癥細胞凋亡等生理過程［8］。NF-κB在TLR4下游信號通路處于樞紐位置，NF-κB家族由一組轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成，其中p65是其中的一個核轉(zhuǎn)錄因子，其活化后，NF-κB與IκB解離并進入細胞核，在細胞核內(nèi)與DNA特定序列結(jié)合，調(diào)節(jié)炎性細胞因子、細胞增殖(抗凋亡)等基因的轉(zhuǎn)錄，參與炎癥調(diào)節(jié)、淋巴細胞成熟、體液免疫、固有免疫和免疫器官的活化等。

表 1 各組 TNF-α、MCP-1、iNOS、IL-6 和 IFN-β mRNA 相對表達量(±s)

表 1 各組 TNF-α、MCP-1、iNOS、IL-6 和 IFN-β mRNA 相對表達量(±s)

注:與 B 組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與 C 組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與 D 組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

組別 TNF-α MCP-1 iNOS IL-6 IFN-β A 組 1.27±0.24 1.28±0.33 0.94±0.09 1.07±0.07 1.12±0.12 B 組 1.14±0.10 1.63±0.27 0.78±0.06 1.30±0.12 1.36±0.25 C 組 2.53±0.24＊＊ 3.32±0.31＊＊ 1.34±0.09＊＊ 4.64±0.38＊＊ 1.95±0.18*D 組 2.16±0.19## 3.36±0.44# 1.22±0.08## 3.91±0.30 2.08±0.18 E 組 1.40±0.17##△△ 2.44±0.35#△ 0.88±0.04##△△ 3.81±0.28#1.97±0.21

表2 各組 p-JNK1/2、NF-κB/p65 蛋白及 TNF-α、IL-6 水平比較(±s)

表2 各組 p-JNK1/2、NF-κB/p65 蛋白及 TNF-α、IL-6 水平比較(±s)

注:與 A組比較，＊＊P ＜0.01;與 B 組比較;#P ＜0.05，##P ＜0.01;與 C 組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

組別 p-JNK1/2 NF-κB/p65 TNF-α(pg/mL) IL-6(pg/mL)A組0.92±0.09 1.04±0.08 14.01±1.35 16.22±1.62 B 組 0.94±0.05 1.17±0.07 14.49±1.24 15.61±1.93 C 組 1.30±0.14* 2.03±0.09＊＊ 40.16±5.08＊＊ 82.10±8.97＊＊D 組 1.17±0.07# 2.03±0.13# 37.59±4.33＊＊ 76.88±8.83＊＊E 組 1.01±0.06#△ 1.78±0.09#△ 20.05±4.26##△△ 40.32±6.74##△△

目前認為，除TLR3外，TLR/NF-κB通路有兩條途徑，MyD88依賴的信號通路主要介導NF-κB活化、細胞因子的產(chǎn)生。調(diào)控啟動細胞因子如MCP-1、TNF-α、IL-6等的表達、增強后繼炎癥因子如iNOS的表達;或者TRAF-6激活JNK途徑(引起JNK1/2的磷酸化)，引導下游通路轉(zhuǎn)錄活化蛋白-1的激活;TLR4的非MyD88依賴途徑，通過細胞因子IRF3的激活調(diào)控IFN-β等相關基因的表達，另外，TRIF還可以與RIP1相互作用，激活IKK1-IKK2-NEMO復合物，進而激活NF-κB。TLR4可被LPS等配體激活，通過MyD88依賴和非依賴兩條途徑進行信號傳遞。

在本實驗中，LPS是TLR4的特異性配體，LPS刺激 RAW264.7巨噬細胞后，炎癥因子 TNF-α、MCP-1、iNOS、IFN-β 和 IL-6 mRNA 明顯升高，NF-κB的活性上調(diào);并引起JNK1/2的磷酸化，激活下游炎癥通路，引起相關炎癥因子TNF-α和IL-6的表達增加。在給予西紅花酸干預后，MyD88依賴途徑的炎癥因子TNF-α、MCP-1、iNOS和IL-6均有明顯下降，p-JNK和NF-κB/p65可被西紅花酸抑制，下游炎癥因子TNF-α和IL-6也明顯降低，和前期研究［2］相一致。通過siRNA對MyD88進行基因沉默后，西紅花酸對TLR4信號通路的上述作用被阻斷，說明西紅花酸對TLR4信號通路的作用可能與MyD88相關。在本研究結(jié)果表1中可以看出，在TLR4非MyD88信號通路中，LPS刺激同樣可以引起IFN-β mRNA升高，但西紅花酸對 IFN-β的作用不明顯，在對MyD88進行基因干擾后，IFN-β mRNA沒有明顯變化。說明在非依賴MyD88信號的TRIF途徑中，西紅花酸和MyD88作用均不明顯。

綜上認為，西紅花酸對TLR4/NF-κB信號途徑的抑制作用主要是通過MyD88依賴途徑實現(xiàn)的。

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