劉樹林，李賽美 ，李小兵，凌 燕，呂冰清

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州 510405)

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寒溫并用方對IL-1β誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡的影響

劉樹林，李賽美*，李小兵，凌 燕，呂冰清

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州 510405)

目的 用細(xì)胞模型探討IL-1β誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡，并觀察寒溫并用方對其保護(hù)作用。方法 MTT觀察寒溫并用方(1、0.5、0.25、0.125 g/L) 分別作用24、48、72 h對INS-1細(xì)胞增殖的影響。寒溫并用方(1、0.5、0.25、0.125 g/L) 預(yù)處理細(xì)胞12 h，50 ng/L IL-1β繼續(xù)處理細(xì)胞24 h，同時(shí)設(shè)空白對照組，IL-1β處理組。Annexin V-FITC流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。Western blotting檢測各組caspase3，bcl-2 Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果 MTT顯示寒溫并用方以時(shí)間劑量依賴性促進(jìn)INS-1細(xì)胞增殖。但1 g/L濃度在作用72 h后與其他濃度比較，顯示明顯的細(xì)胞抑制作用。AnnexinV-FITC/PI結(jié)果顯示IL-1β促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Western blotting 結(jié)果表明IL-1β促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白合成，寒溫并用方抑制其表達(dá)。結(jié)論 寒溫并用方能促進(jìn)INS-1細(xì)胞增殖，并抑制IL-1β誘導(dǎo)INS-1的凋亡，可以用于炎癥性胰島細(xì)胞受損糖尿病的預(yù)防及治療。

寒溫并用方；IL-1β；INS-1；糖尿病

2型糖尿病(T2DM)胰島素抵抗與胰島β細(xì)胞功能異常的可能機(jī)制包括氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、胰島淀粉樣變性、肌肉與肝臟及胰腺部位異位脂肪沉積、脂毒性以及糖毒性等[1]。上述機(jī)制均被認(rèn)為某種炎癥反應(yīng)。在炎癥相關(guān)T2DM患者體內(nèi)可以檢測到組織炎癥，且伴有細(xì)胞因子與趨化因子水平的升高。動(dòng)物模型與人體研究發(fā)現(xiàn)，T2DM伴有胰島的炎癥細(xì)胞浸潤[2]。T2DM患者的胰島組織切片顯示纖維化與淀粉樣沉積，從而給胰島的炎癥反應(yīng)提供了證據(jù)[3]。中醫(yī)認(rèn)為2型糖尿病與消渴病類似，其發(fā)生發(fā)展與“脾”的運(yùn)化功能關(guān)系密切，2型糖尿病患者多食肥甘、運(yùn)動(dòng)量少等生活方式對脾胃的運(yùn)化功能影響極大，脾氣虧虛則水谷不化精微而生痰濕，久則濕郁化熱，故脾陽氣虛、濕熱內(nèi)盛是早期2型糖尿病的主要病機(jī)。李賽美教授臨床使用經(jīng)方葛根芩連湯合理中丸(暫定名為寒溫并用方)寒溫并用治療2型糖尿病，臨床觀察對改善患者癥狀、降低血糖及改善胰島素抵抗均有較好療效。本研究利用IL-1β誘導(dǎo)大鼠胰島素細(xì)胞(INS-1)炎癥樣模型，觀察寒溫并用中藥復(fù)方對其影響，探討寒溫并用方治療2型糖尿病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 MTT檢測試劑盒(廣州市杏海生物 Ginbio)，RPMI 1640完全培養(yǎng)基(Gibco)，IL-1β(peprotech)，胎牛血清(杭州四季青20110628),AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(碧云天C1063)，Caspase-3(武漢博士德)，Bcl-2、Bax(CST),兔抗小鼠二抗(武漢博士德)，western blotting檢測試劑盒(廣州市杏海生物Ginbio)，其余試劑為分析純。酶標(biāo)儀(bio-tek 美國)，電泳電轉(zhuǎn)系統(tǒng)(美國bio-rad)，倒置顯微鏡(廣州粵顯)，激光共聚焦(Leica)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher)。寒溫并用方：葛根40 g，黃連15 g，黃芩15 g，炙甘草15 g，人參15 g，白術(shù)15 g，干姜15 g。(以此比例進(jìn)行配藥)。用純水浸泡4 h以上，煎煮，重復(fù)1次，合并煎煮液。濃縮，采用低溫減壓干燥技術(shù)制備處方浸出物粉末，最終獲得16.36 g粉末，后續(xù)實(shí)驗(yàn)用含血清培養(yǎng)基配制使用藥物濃度。

細(xì)胞培養(yǎng)：INS-1(大鼠胰島素細(xì)胞)，購買于中科院上海細(xì)胞庫。加入含100 mL/L胎牛血清RPMI 1640完全培養(yǎng)基，單層培養(yǎng)和孵化于5% CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃條件下培養(yǎng)。高糖培養(yǎng)葡萄糖濃度為20 mmol/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為對照組，IL-1β組，寒溫并用方處理組(1、0.5、0.25、0.125 g/L)

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 MTT檢測中藥復(fù)方對INS-1的增殖影響 調(diào)整細(xì)胞濃度為5.0×103cell/mL， 接種于96孔板中，每孔100 μL，分為1、0.5、0.25、0.125 g/L、對照組(不加藥)。 每組設(shè)5個(gè)平行孔，并設(shè)空白組(不加細(xì)胞，只加不含藥血清培養(yǎng)基)。放置37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱過夜，待細(xì)胞貼壁后，吸取培養(yǎng)基，用高壓滅菌的PBS洗細(xì)胞一遍，含藥組加入100 μL不同含藥濃度血清的完全培養(yǎng)基,用藥后37 ℃，5% CO2飽和濕度再培養(yǎng)24 h。吸除培養(yǎng)液，加入無血清新鮮培養(yǎng)液。然后每孔加入MTT(5 g/L)15 μL，微量振蕩器震蕩1～2 min，培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h。小心吸除培養(yǎng)基，盡量不要觸及孔底的結(jié)晶。每孔加入DMSO 150 μL，搖床上搖動(dòng)10 min，選擇490 nm作為測定波長，630 nm為參比波長，以空白組調(diào)零，在酶標(biāo)免疫測定儀上測定各孔的吸光度。

1.3.2 流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡 消化對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度5×106/ mL。六孔板每孔加1 mL細(xì)胞懸浮液，過夜貼壁生長。不同藥物濃度預(yù)孵育4 h。對照組除外，其余組加IL-1β，使其濃度為50 ng/mL。24 h后除去細(xì)胞培養(yǎng)液，胰酶消化，收集細(xì)胞，用PBS洗細(xì)胞3次，按Annexin V-FITC 試劑盒操作，然后上流式細(xì)胞儀上檢測，分析凋亡細(xì)胞比例。

1.3.3 Western blotting檢測Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白影響 按照凋亡細(xì)胞檢測方法處理細(xì)胞。收集實(shí)驗(yàn)各組INS-1細(xì)胞，提取總蛋白并用BCA試劑盒測定蛋白濃度。取25 μg總蛋白，8%分離膠和4%濃縮膠進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；然后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至孔徑0.45 μm PVDF膜；取出含目的蛋白的膜，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉1 h；加入一抗4 ℃過夜； PBST洗滌10 min，3次；再加入HRP標(biāo)記的羊抗兔或鼠二抗(均1:10 000)， 孵育2 h；PBST洗滌10 min，3次；用ECL化學(xué)發(fā)光底物顯影，膠片定影。圖片用 Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行光密度值分析，以GAPDH 為內(nèi)參對照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，不同時(shí)點(diǎn)各組INS-1比較，采用兩因素混合設(shè)計(jì)重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析；多組之間細(xì)胞凋亡率、Bcl-2、caspase-3和Bax均數(shù)比較，采用單因素方差分析，采用LSD法(方差齊時(shí))或Dunnett’s T3(方差不齊時(shí))進(jìn)行組間均數(shù)的多重比較。

2 結(jié)果

2.1 寒溫并用方促進(jìn)INS-1細(xì)胞增殖 我們觀察了72 h內(nèi)0.125～1 g/L藥物處理INS-1細(xì)胞。結(jié)果顯示1 g/L作用24、48 h，促進(jìn)INS-1細(xì)胞增殖(P<0.05)，其中1 g/L在72 h后顯示細(xì)胞毒性，抑制細(xì)胞增殖。48 h后0.25、0.5 g/L寒溫并用方促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.05)。結(jié)果見表1。根據(jù)MTT結(jié)果，選擇0.125、0.25、0.5 g/L3個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 寒溫并用方對INS-1細(xì)胞增殖的影響

注：與對照組比較，#P<0.05；與24 h比較，△P<0.05

2.2 寒溫并用方能夠抑制IL-1β誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡

2.2.1 流式細(xì)胞儀AnnexinV-FITC檢測細(xì)胞凋亡影響 與對照組比較，IL-1β誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡率為(24.1±0.69)%(P<0.05)，與IL-1β處理組比較，0.5、0.25 g/L處理組抑制IL-1β誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡(P<0.05)，見表2。

組 別凋亡率/%對照組6．73±1．78#IL?1β24．10±0．69 寒溫并用方0．125g/L20．23±1．96 寒溫并用方0．25g/L14．47±1．03#寒溫并用方0．5g/L6．67±0．61#

注：與IL-1β組比較，#P<0.05

2.2.2 Western blotting檢測凋亡蛋白的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組比較，IL-1β組Bcl-2微弱表達(dá)，但caspase3、Bax 高表達(dá)(P<0.05)。與IL-1β處理組比較，藥物處理組劑量性提高凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)，同時(shí)凋亡蛋白caspase3、Bax被抑制(P<0.05)。見表3。

表3 寒溫并用方對凋亡蛋白表達(dá)的影響 ±s)

注：與IL-1β組比較，#P<0.05

3 討論

近年來，IL-1β在糖尿病患者病理過程作用受到研究者重視。1型糖尿病主要是由于單核細(xì)胞入侵細(xì)胞，產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子IL-1β等引起細(xì)胞數(shù)量與功能極大下降；而2型糖尿病是受飲食或者遺傳的因素，導(dǎo)致產(chǎn)生胰島素抵抗，引起體內(nèi)血糖的升高，進(jìn)而產(chǎn)生大量的IL-1β，引起細(xì)胞功能失調(diào)。由此可見，IL-1β在介導(dǎo)1型與2型糖尿病中均發(fā)揮重要作用[4]。Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，由Bcl-2亞家族、Bax亞家族和BH3亞家族組成。高血糖、游離脂肪酸、胰島素等可誘導(dǎo)2型糖尿病β細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族成員接受誘導(dǎo)凋亡信號后，形成一個(gè)復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞凋亡[5]。Caspase 3在細(xì)胞凋亡中剪切抗凋亡蛋白Bcl-2，發(fā)揮促凋亡作用[6]。一些研究[7-10]證明，中藥及中藥復(fù)方制劑具有減少胰島β細(xì)胞的凋亡、增強(qiáng)胰島細(xì)胞活性等作用，并且能夠上調(diào)Bcl-2基因的表達(dá),下調(diào)Bax基因表達(dá)。

中醫(yī)認(rèn)為2型糖尿病發(fā)病與脾胃功能關(guān)系密切，有研究者[11]通過流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者臨床多存在疲倦、多食口干、大便不暢等癥狀，認(rèn)為其發(fā)病機(jī)理為脾虛、胃熱。李肇翚等[12]對漢唐以來治療消渴病的300余首方劑進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，調(diào)理脾胃的中藥達(dá)一半以上。我們在臨床中發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者，尤其是糖尿病前期及早期2型糖尿病患者多存在胃熱脾寒病機(jī)，臨床中以葛根芩連湯合理中湯寒溫并用進(jìn)行治療，取得較好療效。葛根芩連湯治療糖尿病臨床及實(shí)驗(yàn)研究較多，一般認(rèn)為方中黃連的主要成分小檗堿降糖作用較為確切，如有研究[13]表明，小檗堿可以通過提高葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT-4)的水平等途徑改善胰島素抵抗從而降低血糖。另有一些研究[14-16]表明，小檗堿能夠調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞功能，認(rèn)為可以通過刺激胰島素及胰高血糖素等途徑降低血糖。對葛根芩連湯全方的實(shí)驗(yàn)及臨床研究均表明該方具有明確的調(diào)節(jié)糖代謝、脂代謝、改善胰島素抵抗及改善氧化應(yīng)激等作用[17-19]。單純使用理中湯治療糖尿病的報(bào)道較少，但張智勇[20]曾觀察23例以附子理中湯治療的2型糖尿病患者，結(jié)果表明辨證使用附子理中湯治療2型糖尿病療效顯著。

李賽美教授認(rèn)為，2型糖尿病的基本病機(jī)為虛實(shí)挾雜、寒熱錯(cuò)雜，邪實(shí)主要為濕熱濁毒，正虛主要為脾腎虧虛。在疾病發(fā)生發(fā)展的不同階段虛實(shí)病機(jī)之間的關(guān)系表現(xiàn)不同，如疾病早期，尤其血糖較高未控制時(shí)患者多以濕熱濁毒等邪實(shí)為主，脾腎虧虛為次；而經(jīng)過治療以后，患者濕熱濁毒等邪實(shí)得到祛除，則以脾腎虧虛等正虛為主。但無論哪個(gè)階段都需要注意兩虛實(shí)方面的病機(jī)的存在。臨床常以經(jīng)方葛根芩連湯合理中丸加味治療，根據(jù)患者邪正的對比關(guān)系增減藥量。而且認(rèn)為單純的使用寒涼藥雖能取得一時(shí)血糖的降低，但易損傷先后天之本，對遠(yuǎn)期治療不利；反之，若只以溫陽散寒祛濕等溫?zé)崴幹委?，則對濕熱濁毒之邪的祛除不利，臨床表現(xiàn)為血糖極難控制。故在臨床中以兩方合用，寒溫同治，取得較好的療效。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明寒溫并用方可能通過抑制凋亡蛋白caspase-3、Bax的表達(dá)，并提高凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而起到抑制胰島細(xì)胞凋亡的作用；而且寒溫并用方呈劑量及時(shí)間依賴性的促進(jìn)INS-1細(xì)胞增殖。

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Hanwenbingyong prescription inhibited IL-1β-induced apoptosis in INS-1

LIU Shulin,LI Saimei*,LI Xiaobing,LING Yan,LYU Bingqing

(First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405,China)

Objective To investigate cellular model IL-1β-induced apoptosis in INS-1 cells,and observe the protective effect of Hanwenbingyong prescription.Methods The effects of Hanwenbingyong prescription (1,0.5,0.25,0.125 g/L) on proliferation of INS-1 cell were observed by MTT after acting 24,48 and 72 h.Hanwenbingyong prescription (1,0.5,0.25,0.125 g/L) pretreated cell for 12 h,and then 50 ng/L IL-1β-treated cells continue to 24 h.At the same time,made control group and IL-1β treatment group.Apoptosis was detected by V-FITC Annexin flow cytometry.Expression of Caspase3 and Bax Bcl-2 was detected by Western blotting.Results MTT showed Hanwenbingyong prescription promoted proliferation of INS-1 cells with a time and dose dependence.But the cells of 1g/L concentration were better than other groups after effected 72h.AnnexinV-FITC/PI showed that IL-1β promoted apoptosis.Western blotting showed that IL-1β promoted apoptosis protein synthesis,Hanwenbingyong prescription inhibited expression of IL-1β.Conclusion Hanwenbingyong prescription can promote proliferation of INS-1 cells,and inhibit the apoptosis of INS-1 induced by IL-1β,which can be used in prevention and treatment of inflammatory islet cell damage.

Hanwenbingyong prescription; IL-1β; INS-1; diabetes

10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.12.025

廣東省中醫(yī)藥局科研課題基金資助項(xiàng)目(20131168)。

劉樹林(1979-)，男，主治醫(yī)師，博士，從事內(nèi)分泌疾病的中西醫(yī)結(jié)合治療與研究。

R259

A

1003-5699(2015)12-1268-04

趙玉芝

2015-07-08)

*通信作者：李賽美，博士，教授，電子信箱-Lisaimei2004@163.com