張慶華，朱克儉，黃 敏，郭喜庚

（1.湖南方盛制藥股份有限公司，湖南 長沙 410205；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410006）

藤黃健骨制劑已上市應(yīng)用多年，經(jīng)臨床用藥反饋和總結(jié)，可用于治療骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、頸椎病、腰椎間盤突出癥等病，中醫(yī)辨證屬腎虛血瘀證者。為探討該藥治療骨質(zhì)疏松癥的藥理作用，基于其以“補(bǔ)腎”為主、兼顧“活血止痛”的治則定位，本研究采用地塞米松肌肉注射和維甲酸灌胃的方法制作大鼠骨質(zhì)疏松模型，系統(tǒng)觀察和評價藤黃健骨片對動物模型的改善作用?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

動物：SD大鼠120只，體質(zhì)量140～200g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，動物合格證號004202、004528。

藥物：藤黃健骨片由熟地黃、肉蓯蓉、淫羊藿、鹿銜草、骨碎補(bǔ)、雞血藤、萊菔子（炒）組成，由湖南方盛制藥股份有限公司提供，批號20100303。陽性對照藥用依普黃酮片，0.2g/片，由湖北四環(huán)制藥有限公司提供。

試劑：大鼠雌二醇（E2） 定量酶聯(lián)檢測試劑盒（ELISA Kit for Rat E2），大鼠降鈣素（CT）定量酶聯(lián)檢測試劑盒（ELISA Kit for Rat CT），長沙維爾生物科技有限公司進(jìn)口分裝，批號101201。

造模：地塞米松誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松動物模型[1]。①選用SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～200g，肌肉注射地塞米松1mg/kg，2次/周，空白對照組注射生理鹽水，連續(xù)6周，誘導(dǎo)形成骨質(zhì)疏松模型。②分組與給藥：造模6周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分成模型組、依普黃酮片組（陽性藥組）、藤黃健骨片低劑量組、中劑量組、高劑量組（低、中、高劑量組）。按表1劑量灌胃給藥14天后處理動物。于末次給藥1h后取血測定血清鈣、堿性磷酸酶、雌二醇、降鈣素；處死后取股骨做骨力學(xué)測定。

維甲酸誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松動物模型[2]。①取雄性SD大鼠，體質(zhì)量140～160g，按75mg/kg維甲酸（以1%纖維素溶液配成15%濃度）灌胃，日1次，連續(xù)2周后停藥。常規(guī)飼養(yǎng)，4周后誘導(dǎo)形成骨質(zhì)疏松模型。②分組與給藥：造模4周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分成模型組、依普黃酮片組、藤黃健骨片低、中、高劑量組。按表2劑量灌胃給藥14天后處理動物。于末次給藥1h后取血測定血清鈣、堿性磷酸酶。

2 結(jié) 果

藤黃健骨片對血液生化指標(biāo)的影響。研究結(jié)果顯示，與模型組比較，藤黃健骨片高劑量組能提高兩種骨質(zhì)疏松動物模型大鼠血清鈣水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；依普黃酮片對地塞米松誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松模型能提高其血清鈣水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，藤黃健骨片高劑量組和依普黃酮片組的血清堿性磷酸酶水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1、表2。

表1 藤黃健骨片對地塞米松誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型大鼠血液生化指標(biāo)的影響 （±s）

表1 藤黃健骨片對地塞米松誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型大鼠血液生化指標(biāo)的影響 （±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。

堿性磷酸酶（U/L）空白組 10 / 1.56±0.14 102.90±12.99模型組 10 / 1.39±0.12** 124.50±18.42**依普黃酮組 10 0.1 1.51±0.11△ 107.20±11.50△藤黃健骨低劑量組 10 1.2 1.45±0.11 112.20±14.77藤黃健骨中劑量組 10 2.4 1.50±0.12 110.33±13.58藤黃健骨高劑量組 10 4.8 1.52±0.11△ 106.33±14.38△組別 n 劑量（g/kg）鈣（mmol/L）

表2 藤黃健骨片對維甲酸誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型大鼠血液生化指標(biāo)的影響 （±s）

表2 藤黃健骨片對維甲酸誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型大鼠血液生化指標(biāo)的影響 （±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。

堿性磷酸酶（U/L）空白組 10 / 1.70±0.147 96.90±12.53模型組 10 / 1.55±0.075** 117.90±15.88**依普黃酮組 10 0.1 1.61±0.083 104.60±11.06△藤黃健骨低劑量 10 1.2 1.60±0.083 107.10±9.64藤黃健骨中劑量 10 2.4 1.63±0.084 104.44±13.18藤黃健骨高劑量 10 4.8 1.63±0.063△ 103.11±14.19△組別 n 劑量（g/kg）鈣（m mol/L）

藤黃健骨片對血清激素水平的影響。研究結(jié)果表明，與模型組比較，藤黃健骨片高劑量組能顯著提高大鼠血清降鈣素水平；藤黃健骨片中、高劑量組和依普黃酮片組能明顯提高血清雌二醇水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 藤黃健骨片對地塞米松誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型大鼠血清激素的影響 （±s）

表3 藤黃健骨片對地塞米松誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型大鼠血清激素的影響 （±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

雌二醇（pmol/L）空白組 10 64.03±6.99 14.00±3.61模型組 10 42.20±7.16** 7.05±1.66**依普黃酮組 10 48.27±7.84 8.61±1.58△藤黃健骨低劑量組 10 46.77±9.32 8.54±1.83藤黃健骨中劑量組 10 49.30±9.48 9.00±2.24△△藤黃健骨高劑量組 10 50.19±8.97△ 9.96±2.89△組別 n 降鈣素（pg/mL）

藤黃健骨片對骨力學(xué)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠的股骨最大彎曲力、抗彎強(qiáng)度與斷裂撓度均有顯著性降低（P＜0.05）；與模型組比較，藤黃健骨片低、中、高劑量組明顯提升雄性大鼠的最大彎曲力；高劑量組能明顯提升雌性大鼠的最大彎曲力，藤黃健骨片低、中、高劑量組和依普黃酮片組的抗彎強(qiáng)度、斷裂撓度均有顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 藤黃健骨片對地塞米松誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型大鼠骨力學(xué)的影響 （±s）

表4 藤黃健骨片對地塞米松誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型大鼠骨力學(xué)的影響 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

斷裂撓度fbb（mm）空白組n=10組別 性別 最大彎曲力Fbb（N）抗彎強(qiáng)度σbb（Mpa）♀ 137.89±12.70 233.24±18.14** 0.50±0.07*♂ 187.17±21.06**238.01±40.30* 0.45±0.04*依普黃酮組n=10♀ 153.08±12.00 281.84±15.04 0.59±0.06♂ 230.91±21.67 293.04±17.82 0.54±0.07模型組n=10♀ 134.89±11.43 271.02±12.35△△ 0.52±0.05♂ 187.29±33.69 280.15±18.07△ 0.54±0.06△藤黃健骨低劑量組n=10♀ 137.12±9.32 272.76±14.97△△ 0.53±0.05♂ 222.00±28.43△ 276.85±14.99△ 0.55±0.04△△藤黃健骨中劑量組n=10♀ 138.90±15.67 280.66±34.91△ 0.58±0.06♂ 224.10±56.33△ 316.51±36.05△△ 0.57±0.06△△♀ 151.68±5.30△ 290.04±18.15△△ 0.51±0.02♂ 236.76±43.22△ 294.68±13.08△△ 0.55±0.06△△藤黃健骨高劑量組n=10

3 討 論

骨質(zhì)疏松癥 （osteoporosis，OP）是以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易于發(fā)生骨折為特點(diǎn)的全身性骨病。本病分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類，繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥是指由任何影響骨代謝的疾病或藥物所致的骨質(zhì)疏松癥。骨質(zhì)疏松癥是慢性、漸進(jìn)性、退化性疾病，隨著年齡增長，患病風(fēng)險增加，故一般多見于絕經(jīng)后婦女和老年男性[3，4]。

骨質(zhì)疏松癥屬中醫(yī)“骨痿”、“骨枯”、“骨痹”、“骨極”等范疇?！端貑枴ば魑鍤狻?、《素問·陰陽應(yīng)象大論》提出，“藏真下于腎，腎藏骨髓之氣也”，“腎主身之骨髓”?！端貑枴ゐ粽撈吩唬骸澳I主身之骨骼，……腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿?！北静“l(fā)病多因脾腎虧虛，首責(zé)腎虛，其次是脾虛不健，運(yùn)化不足，氣血生化無源，致骨失所養(yǎng)，筋骨不堅(jiān)，髓枯骨痿；或因老年元?dú)獠蛔?，瘀血?nèi)阻，氣血運(yùn)行受阻。中醫(yī)辨證當(dāng)為本虛標(biāo)實(shí)，臨床常見證候有腎虛（肝腎陰虛、脾腎陽虛）、脾虛、血瘀（氣滯血瘀、氣虛血瘀）；虛則補(bǔ)益，實(shí)則通達(dá)，補(bǔ)腎為主，標(biāo)本兼顧，治療總的組方原則是補(bǔ)腎活血、益氣健脾、強(qiáng)筋健骨、舒筋活絡(luò)[5，6]。

目前常用骨質(zhì)疏松癥動物模型的誘導(dǎo)方法有糖皮質(zhì)激素、維甲酸、環(huán)磷酰胺、酒精、去卵巢等所致者，其他的還有轉(zhuǎn)基因（基因剔除）和腦源性模型。有研究資料表明[7]，長期或大量使用糖皮質(zhì)激素可以導(dǎo)致骨質(zhì)疏松且并發(fā)骨折，常用藥物有地塞米松、強(qiáng)的松等。其發(fā)生機(jī)制是糖皮質(zhì)激素可以增加RANKL的表達(dá)，下調(diào)護(hù)骨素（OPG）水平，從而抑制成骨細(xì)胞活性，活化破骨細(xì)胞，促進(jìn)骨吸收和局部細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致骨代謝失衡；且抑制腸鈣吸收和骨鈣、磷重吸收，抑制腎小管鈣的重吸收，促進(jìn)骨質(zhì)疏松的形成。此外，致骨細(xì)胞自噬可能也是機(jī)制之一。維甲酸又稱維A酸，是體內(nèi)Vitamin A的中間代謝產(chǎn)物。本品既有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化的作用，又能增強(qiáng)破骨細(xì)胞的骨吸收，且促骨吸收作用占優(yōu)勢，故其總的結(jié)果是導(dǎo)致骨量減少，可造成骨形成與骨吸收都活躍的高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松模型。

選用地塞米松和維甲酸兩種方法誘導(dǎo)形成骨質(zhì)疏松動物模型，觀察血液生化指標(biāo)（鈣、堿性磷酸酶）、血清激素水平（雌二醇、降鈣素）和骨力學(xué)的變化情況。鈣是構(gòu)成骨礦物質(zhì)的主要成分，其絕大部分都儲存在骨組織中。若因鈣攝入不足、吸收低下，血鈣水平下降，可使甲狀旁腺激素（PTH）分泌增多，造成破骨細(xì)胞活性加強(qiáng)。堿性磷酸酶與鈣一樣參與骨代謝，在血液中保持一個穩(wěn)定的數(shù)值。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組相比，模型組的血清鈣水平明顯降低，堿性磷酸酶水平則明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，藤黃健骨片高劑量組能明顯提高大鼠血清鈣水平，且其血清堿性磷酸酶水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與骨質(zhì)疏松癥發(fā)生相關(guān)的最重要激素包括雌激素和降鈣素。雌激素能抑制骨鈣融出，且可增強(qiáng)骨細(xì)胞活動，同時還可協(xié)助活性維生素D在腎內(nèi)的合成；降鈣素通過與破骨細(xì)胞上的降鈣素受體結(jié)合，抑制骨吸收，同時也可抑制甲狀旁腺激素和活性維生素D的活性，降低血鈣濃度，促進(jìn)鈣重吸收。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藤黃健骨片高劑量組能顯著提高大鼠血清降鈣素水平；藤黃健骨片中、高劑量組能明顯提高血清雌二醇水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。骨力學(xué)是生物力學(xué)的重要分支，主要研究骨組織在外力作用下的力學(xué)特性和骨受力后的生物學(xué)效應(yīng)，是對骨質(zhì)量的直接評價，也是評價各種對抗骨量低下和骨強(qiáng)度下降措施的最佳指標(biāo)之一[8]。骨質(zhì)疏松癥的基本特點(diǎn)就是骨強(qiáng)度下降、骨折風(fēng)險增加，這與骨的抗外力作用減退有著直接的關(guān)系，因此，評價骨的力學(xué)特性是研究骨質(zhì)疏松癥的又一個重要指標(biāo)，包括最大彎曲力、抗彎強(qiáng)度、斷裂撓度。本實(shí)驗(yàn)采用骨力學(xué)作為評價藥物干預(yù)作用的主要指標(biāo)之一，結(jié)果顯示，與模型組比較，藤黃健骨片低、中、高劑量組（雄性）和高劑量組（雌性）的最大彎曲力有明顯提高，藤黃健骨片低、中、高劑量組的抗彎強(qiáng)度和斷裂撓度均有顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示藤黃健骨片能較好的改善骨力學(xué)特性。

藤黃健骨片處方來源于國醫(yī)大師劉柏齡教授臨證經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，是經(jīng)多年臨床應(yīng)用凝練并研制而成的中藥復(fù)方制劑[9]。全方用藥精煉，共由7味藥組成，重用熟地黃為君，滋陰補(bǔ)血，益精填髓；臣藥用肉蓯蓉、淫羊藿、骨碎補(bǔ)、鹿銜草，分別取其補(bǔ)腎陽、益精血、入腎生髓以治其本，祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、強(qiáng)筋止痛以治其標(biāo)，佐以雞血藤，補(bǔ)血、活血、通經(jīng)絡(luò)、強(qiáng)筋骨；使藥為萊菔子，消食、理氣，以防補(bǔ)而滋膩之弊。諸藥配伍，共奏補(bǔ)腎、活血、止痛之功。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究從探索藥物的藥理效應(yīng)角度出發(fā)，初步驗(yàn)證了藤黃健骨片治療骨質(zhì)疏松癥的作用。作為中藥復(fù)方制劑，其組方配伍和相關(guān)的藥效物質(zhì)較為復(fù)雜，通過藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)把藤黃健骨片的理法方藥與現(xiàn)代藥理學(xué)研究相結(jié)合，為藥物的臨床科學(xué)合理使用提供確切的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

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