司紅彬，吳永繼，徐素萍，黃麗云，秦 燕，姚曉韻，潘 婕，黃 凱＊，夏 娟，唐承明

（1廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院；廣西南寧530005；2廣西壯族自治區(qū)獸藥監(jiān)察所；廣西南寧530001）

白頭翁為臨床常用清熱涼血藥之一，屬于毛莨科植物白頭翁Pulsatilla chinensis（Bunge）Regel的干燥根，多分布于河南、山東、吉林、黑龍江等地區(qū)。味苦性寒，歸胃、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、涼血止痢之功效，是治痢之要藥。臨床用于治療阿米巴痢疾、細(xì)菌性痢疾和抗陰道滴蟲等疾?。?－3］?，F(xiàn)代研究表明該藥具有抗病毒［4］，對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、痢疾桿菌有抑制作用［5］，也有研究報道該藥還具有抗炎、提高免疫力、保肝、抗腫瘤作用［6－7］，可能對日本血吸蟲感染有一定的治療和預(yù)防作用［8］。目前，細(xì)菌耐藥性問題越來越嚴(yán)重，畜牧養(yǎng)殖領(lǐng)域也是如此，甚至連養(yǎng)殖領(lǐng)域的細(xì)菌對獸醫(yī)領(lǐng)域嚴(yán)禁使用的藥物都能產(chǎn)生耐藥性，如磷霉素。磷霉素為獸醫(yī)領(lǐng)域臨床嚴(yán)禁使用的藥物，目前分離到含該耐藥基因的文獻(xiàn)報道還不多［9］，理論上不應(yīng)該在獸醫(yī)領(lǐng)域分離到耐磷霉素基因（fosfomycin resistance gene，fosA3）的細(xì)菌。但2013年文獻(xiàn)報道中國從食品源動物分離到10株產(chǎn)fosA3耐藥基因的大腸埃希菌［10］。本次試驗分離到同時含有質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜β－內(nèi)酰胺酶（extended spectrum betalactamases，ESBLs）和fosA3基因的大腸埃希菌，并通過白頭翁水提取物聯(lián)合抗菌藥對臨床分離同時含fosA3型和ESBLs型耐藥基因的大腸埃希菌體外抑菌效果進(jìn)行研究，為該類耐藥性細(xì)菌感染疾病的防治提供治療方法。

1 材料與方法

1.1 材料

白頭翁購自廣西萬豐藥業(yè)有限公司，腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管、MH 肉湯、SS瓊脂、麥康凱瓊脂均為杭州天河微生物試劑有限公司；抗菌藥：頭孢曲松鈉（ceftriaxone sodium）、阿莫西林（amoxicillin）、諾氟沙星（norfloxacin）、加替沙星（gatifloxacin）、鹽酸環(huán)丙沙星（ciprofloxacin）、左旋氧氟沙星（levofloxacin）、黏桿菌素（coly－mycin）、痢菌凈（mequindox）、磺胺間甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine）、阿米卡星（amikacin）、頭 孢 他 啶（ceftazidime）、頭 孢 噻 呋 鈉（ceftiofur sodium）、氟苯尼考（florfenicol）、磷霉素（fosfomycin）均在有效期范圍內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離鑒定 從病雞的典型病變組織肝臟中無菌釣取部分病料，于麥康凱瓊脂平板和SS平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)18h，挑取單個菌落接種于MH 肉湯，進(jìn)行培養(yǎng)和再純化，然后按照生化鑒定管方法對菌落進(jìn)行鑒定。

1.2.2 白頭翁水提取物制備 稱取白頭翁100g，用蒸餾水清洗并浸泡4h，然后分別加入中藥體積的10、8、6倍體積的水進(jìn)行煎煮，煎煮時每次煮沸后改為文火繼續(xù)煎煮1h，過濾。合并3次濾液并進(jìn)行濃縮，使中藥的終濃度為1g／mL，高壓滅菌后冷藏備用。

1.2.3 中藥提取物和抗菌藥最小抑菌濃度的測定

參照CLSI（2008）［11］推薦的微量二倍稀釋法測定各藥物對分離到細(xì)菌的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concertration，MIC），并對結(jié)果進(jìn)行判定該菌是否耐藥。

1.2.4 耐藥菌fosA3型和ESBLs型基因的檢測

1.2.4.1 引物合成 根據(jù)GenBank登錄的基因序列，設(shè)計fosA3 和ESBLs亞型引物：fosA3 上游引物：5′－GCGTCAAGCCTGGCATTT－3′；fosA3 下游引物：3′－GCCGTCAGGGTCGAGAAA－5′。TEM上游引物：5′－AGGAAGAGTATGATTCAACA－3′；TEM 下 游 引 物：5′－CTCGTCGTTTGGTATGGC－3′。CTX－M 上 游 引 物：5′－GGGCTGAGATGGTGACAAAGAG－3′；CTX－M 下 游 引 物：5′－CGTGCGAGTTCGATTTATTCAAC－3′。SHV 上游引物：5′－GGTTATGCGTTATATTCGCCTGTG－3′；SHV 下 游 引 物：5′－TTAGCGTTGCCAGTGCTCGATCA－3′。以上引物全部由由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計合成。

1.2.4.2 反應(yīng)體系 50μL 反應(yīng)體系：模板DNA 2μL，Taq 酶0.5μL，dNTP 4μL，buffer 5μL，上游、下游引物各2μL，去離子水34.5μL。不同類型和亞型基因的退火溫度為：fosA3（55℃）、TEM（52℃）、SHV（57℃）、CTX－M（55℃），設(shè)陰性對照，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外投射儀下觀察結(jié)果并用凝膠成像系統(tǒng)攝像。

1.2.5 中藥水提物與抗菌藥聯(lián)合誘導(dǎo)抑制試驗以含有亞抑菌濃度的白頭翁水提取物的MH 肉湯作為培養(yǎng)基，聯(lián)合各抗菌藥傳代培養(yǎng)3次，采用常規(guī)2倍微量測定中西藥聯(lián)合對耐藥菌的MIC，觀測被中藥作用3代后細(xì)菌對抗菌藥MIC的變化。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

細(xì)菌純化培養(yǎng)后，該菌在麥康凱平板上為玫瑰紅色、圓形、表面光滑的菌落，在SS瓊脂平板上為紅色菌落（圖1）；將純化后的細(xì)菌接種生化培養(yǎng)鑒定管鑒定，確定為大腸埃希菌。

2.2 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，該菌同時含有3個耐藥基因分別為fosA3型、TEM 型和CTX－M 型，見圖2。由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，結(jié)果表明，TEM 型擴(kuò)增產(chǎn)物堿基的長度為521 bp，CTX－M 型擴(kuò)增產(chǎn)物堿基的長度為876bp，fosA3擴(kuò)增產(chǎn)物堿基的長度為258bp。

圖1 細(xì)菌在不同培養(yǎng)基上的生長Fig.1 Growth of colonies in different medium

2.3 單藥最小抑菌濃度測定結(jié)果及中西聯(lián)合作用細(xì)菌結(jié)果

白頭翁水提取物MIC 大于0.5g／mL。結(jié)果表明：各抗菌藥的單藥MIC 值較高（表1），根據(jù)CLSI（2010）判斷標(biāo)準(zhǔn)可判定該菌對各抗菌藥均表現(xiàn)為耐藥。中西聯(lián)合作用3代后，中藥可明顯降低各抗菌藥的MIC值，頭孢曲松鈉、阿莫西林、頭孢他啶、頭孢噻呋鈉、氟苯尼考從第1代就開始降低。

結(jié)果表明，以亞抑菌濃度白頭翁水提取物聯(lián)合抗菌藥對耐藥菌作用3 代，可使其MIC 值明顯降低，上述白頭翁水提取物對含fosA3型、TEM 型和CTX－M 型耐藥基因的大腸埃希菌對各抗菌藥的MIC均降低到原來1／4以下，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)可判斷白頭翁水提取物對耐藥大腸埃希菌具有較好的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，白頭翁聯(lián)合抗菌藥可對耐藥大腸埃希菌感染的疾病進(jìn)行較好的治療。

表1 抗菌藥單藥MIC和白頭翁水提物與抗菌藥聯(lián)合作用的MIC（μg／mL）Table 1 The MIC of antimicrobials and Pulsatilla chinensis water extract combination with antimicrobials

3 討論

白頭翁始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，藥用部位為其根。白頭翁根的主要有效成分為三萜皂苷、三萜酸、木脂素、胡蘿卜苷以及糖蛋白等成分［12］?，F(xiàn)代研究表明白頭翁素具有顯著的抗菌消炎和增強免疫功能的作用，可減輕腸道黏膜損傷并加速腸黏膜的修復(fù)［13］。白頭翁治療大腸埃希菌的研究報道也不少，有文獻(xiàn)報道白頭翁散對耐熱腸毒素大腸桿菌病治愈率為86%，效果顯著［14］，方向紅報道白頭翁的水提物抗豬大腸埃希菌效果不錯［15］，李文超等［16］采用不同的溶媒對白頭翁進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)不同溶劑的提取物的都有抗菌效果，但作用效果差異不明顯。本試驗采用水煮液，也發(fā)現(xiàn)白頭翁對耐藥菌具有一定的抑制作用，與文獻(xiàn)報道白頭翁對大腸埃希菌具有一定的抑菌作用報道一致。

目前中藥具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用的報道文獻(xiàn)也較多，并且不同的中藥具有耐藥逆轉(zhuǎn)的機(jī)理不同。中藥主要是通過以下機(jī)理實現(xiàn)耐藥逆轉(zhuǎn)作用：①中藥消除R 質(zhì)粒［17］；②中藥抑制β－內(nèi)酰胺酶。細(xì)菌產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶可以水解β－內(nèi)酰胺環(huán)類藥物，尤其產(chǎn)生的ESBLs［18］；③中藥影響細(xì)菌的生長速度和蛋白表達(dá)量，進(jìn)而改變細(xì)菌的耐藥性［19－20］；④中藥對耐藥細(xì)菌外排泵抑制作用［21－22］。本次試驗通過白頭翁水提取物連續(xù)誘導(dǎo)含3種耐藥基因的大腸埃希菌，發(fā)現(xiàn)被中藥提取物作用后的耐藥菌對常見抗菌藥的MIC明顯降低，且降低到原來MIC 的1／4以下，說明白頭翁可讓耐藥大腸埃希菌對該試驗中用到的抗菌藥具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用，至于其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。綜上所述，采用白頭翁水提取物聯(lián)合抗菌藥可以作為一種治療同時含fosA3 型、TEM 型和CTX－M 型耐藥基因的大腸埃希菌感染疾病的較好方案，可以用于臨床推廣。

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