金有訓(xùn) 石蓮花 武利慶 王 晶

(中國計量科學(xué)研究院，北京 100029)

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蛋白質(zhì)純化分析儀校準方法及其不確定度評定*

金有訓(xùn) 石蓮花 武利慶 王 晶

(中國計量科學(xué)研究院，北京 100029)

本文研究建立了一種蛋白質(zhì)純化分析儀的校準方法，確定了蛋白質(zhì)純化分析儀的主要計量特性包括泵系統(tǒng)的流量設(shè)定值誤差SS、流量穩(wěn)定性極差SR、紫外-可見檢測器的基線噪聲和基線漂移、儀器整機性能的定性、定量測量重復(fù)性、pH和電導(dǎo)測定重復(fù)性等。介紹了采用人生長激素溶液標準物質(zhì)、氯化鉀電導(dǎo)率標準溶液和pH標準溶液對儀器主要計量特性指標進行校準的過程，并對流量設(shè)定值誤差的不確定度評定進行了討論。本研究工作有助于保證蛋白質(zhì)純化分析儀測定結(jié)果的準確性和溯源性，并為蛋白質(zhì)純化分析儀校準規(guī)范的制定奠定基礎(chǔ)。

蛋白質(zhì)純化分析儀；計量特性；校準；不確定度

0 引言

蛋白質(zhì)是生物體中廣泛存在的一類生物大分子，由核酸編碼的a -氨基酸之間通過a -氨基和a -羧基形成的肽鍵連接而成的肽鏈，經(jīng)翻譯后加工而生成的具有特定立體結(jié)構(gòu)的、有活性的大分子。隨著生命科學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展以及生物產(chǎn)業(yè)的興起，蛋白質(zhì)純化分析在臨床檢驗、食品安全、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用與日俱增，蛋白質(zhì)純度與大眾健康緊密相連。許多重要的臨床生化指標都離不開蛋白質(zhì)的純化及純度分析，并且臨床檢驗儀器的檢定和校準同樣也離不開高純度蛋白質(zhì)標準物質(zhì)。

蛋白質(zhì)純化分析儀根據(jù)所要純化的目的蛋白的特性，利用液相色譜結(jié)合不同的色譜柱可以進行凝膠過濾、離子交換、疏水層析、反相層析和親和層析，可用于分離和純化各種生物分子，包括天然蛋白質(zhì)，重組和融合蛋白質(zhì)、肽、寡核苷酸、質(zhì)粒、病毒、抗生素、生物堿等，可以檢測、分離、純化環(huán)境微生物、植物、動物和人體中的多種生物分子[1-3]。尤其適用于檢測、純化、分離制備蛋白質(zhì)，包括已知和未知蛋白質(zhì)的純化，蛋白藥物的分離，病毒等生物顆粒的分離[4]。顯然蛋白質(zhì)純化分析儀的性能將會影響到蛋白質(zhì)檢測、分離、純化的最終結(jié)果。

因此，為了保證分析結(jié)果的準確，有必要對蛋白質(zhì)純化分析儀的性能進行校準和質(zhì)量控制。迄今為止，國家尚未出臺有關(guān)蛋白質(zhì)純化分析儀的檢定規(guī)程或校準規(guī)范，并且蛋白質(zhì)純化分析儀的需求和數(shù)量是日益增長的，確保其結(jié)果的準確性和溯源性有必要對儀器性能進行校準和質(zhì)量控制。因此，本工作對蛋白質(zhì)純化分析儀的計量特性指標及其校準方法進行了研究，并對計量特性指標中流量設(shè)定值誤差的不確定度評定進行了討論，滿足了蛋白質(zhì)純化分析儀的質(zhì)量控制和校準的需求。

1 計量特性和計量標準

蛋白質(zhì)純化分析儀通常采用高效液相色譜原理，它是由泵系統(tǒng)、進樣器、色譜柱(柱溫箱)、紫外-可見 (UV-Vis) 檢測器、在線電導(dǎo)和pH檢測的組合檢測器和數(shù)據(jù)處理裝置等部分組成。蛋白質(zhì)純化分析儀利用樣品中各組分在色譜柱內(nèi)固定相和流動相間分配或吸附特性的差異，由流動相將樣品帶入色譜柱中進行分離，經(jīng)檢測器檢測，依據(jù)各組分的保留時間和響應(yīng)值(峰面積或峰高)進行定性和定量分析。泵系統(tǒng)是蛋白質(zhì)純化分析儀中很重要的部件之一，泵的性能好壞直接影響到整個系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性?？紤]到蛋白質(zhì)純化分析儀的泵系統(tǒng)流量是否穩(wěn)定可能影響到蛋白質(zhì)純化分析儀檢測、分離、純化結(jié)果的準確度和精密度，特別是影響到定性定量的準確性。因此，參照JJG 705—2014 《液相色譜儀檢定規(guī)程》，將泵系統(tǒng)的流量設(shè)定值誤差SS和流量穩(wěn)定性極差SR作為一項計量特性。檢測器是蛋白質(zhì)純化分析儀的關(guān)鍵部件之一，其中紫外-可見檢測器的基線噪聲和基線漂移都會影響測定結(jié)果的準確度，尤其是影響到定性定量的準確性和精密性，因此，將紫外-可見檢測器的基線噪聲和基線漂移作為計量特性之一[5]。儀器整機性能的定性、定量測量重復(fù)性好壞也會影響到定性定量的準確性，也應(yīng)作為計量特性之一。此外，pH和電導(dǎo)率重復(fù)性[6]穩(wěn)定也將影響到蛋白質(zhì)純化分析儀檢測、分離、純化結(jié)果的準確度和精密度，也將其性能作為計量特性。通過參考相關(guān)的檢定規(guī)程和查閱大量技術(shù)資料，我們反復(fù)做了相關(guān)計量特性有關(guān)的實驗，最終確定了蛋白質(zhì)純化分析儀泵系統(tǒng)的流量設(shè)定值誤差SS、流量穩(wěn)定性極差SR、紫外-可見檢測器的基線噪聲和基線漂移、儀器整機性能的定性、定量測量重復(fù)性、pH和電導(dǎo)測定重復(fù)性等作為計量特性。各種計量特性指標要求見表1和表2。校準過程中使用的計量標準和計量儀器如表3所示。

表1 泵流量設(shè)定值誤差SS和泵流量穩(wěn)定性極差SR的指標要求

表2 蛋白質(zhì)純化分析儀的主要技術(shù)指標

表3 蛋白質(zhì)純化分析儀校準過程中使用的計量標準與計量儀器

2 校準方法

實驗室環(huán)境應(yīng)當滿足儀器安裝的要求，周圍無強烈機械振動和電磁干擾源，儀器接地良好，蛋白純化分析儀周圍環(huán)境的溫度應(yīng)當控制在15～30℃，相對濕度在20%～85%環(huán)境中進行測試，配套使用的流動相應(yīng)當新鮮配制。接通儀器電源后預(yù)熱10 min，待儀器各電子器件狀態(tài)穩(wěn)定后開始測試。然后按照下述步驟進行實驗。

2.1 泵流量設(shè)定值誤差Ss、流量穩(wěn)定性極差SR的檢測

蛋白質(zhì)純化分析儀流量設(shè)定值誤差Ss、流量穩(wěn)定性極差SR檢測的相關(guān)步驟以及計算公式是參照JJG 705—2014 《液相色譜儀檢定規(guī)程》，以純水為流動相，按表1指標的要求，啟動儀器，壓力穩(wěn)定后，在流動相出口處用事先清洗稱重過的容量瓶收集流動相，自動收集設(shè)定時間流出的流動相，在分析天平上稱重，重復(fù)測量3次，按式(1)、式(2)和式(3)計算SS和SR。

Fm= (W2-W1)/(ρ(t)

(1)

(2)

(3)

2.2 基線噪聲和基線漂移的檢測

以純水為流動相，流量為1.0mL/min，紫外檢測器的波長選在215nm，檢測靈敏度調(diào)到最靈敏擋。開機預(yù)熱，待儀器穩(wěn)定后記錄基線30min，計算基線噪聲，用檢測器自身的物理量(AU) 作單位表示?；€漂移用30min內(nèi)基線偏離原點的值(AU/30min) 表示。

2.3 電導(dǎo)率重復(fù)性的檢測

開機后先用純水以5mL/min流速清洗系統(tǒng)5min，然后，用氯化鉀電導(dǎo)率溶液標準物質(zhì)[6]預(yù)平衡系統(tǒng)，重復(fù)測量標準溶液共6次，記錄儀器的電導(dǎo)率，按式(4)計算相對標準偏差作為重復(fù)性的表征。

(4)

2.4 pH重復(fù)性的檢測

測pH重復(fù)性時先用純水以5 mL/min流速清洗系統(tǒng)5 min，然后，用pH標準溶液預(yù)平衡系統(tǒng)，重復(fù)測量pH標準溶液pH值共6次，記錄儀器的pH值，按式(4)計算相對標準偏差作為重復(fù)性的表征。

2.5 整機性能的定性、定量重復(fù)性的檢測

參照JJG 705—2014《液相色譜儀檢定規(guī)程》，將儀器各部分連接好，選用凝膠過濾、離子交換色譜、疏水作用色譜、親和層析色譜等色譜柱，選擇相適應(yīng)的流動相和測量參數(shù)，檢測波長為215nm，基線穩(wěn)定后由注射器注入50μL的1mg/mL人生長激素溶液標準物質(zhì)進行測試。連續(xù)測量6次，分別記錄色譜圖中相應(yīng)的保留時間和峰面積，根據(jù)式(4)，以峰面積的相對標準偏差計算定量重復(fù)性，以保留時間的相對標準偏差計算定性重復(fù)性。

3 不確定度評定

本研究對泵流量設(shè)定誤差進行了不確定度評定。根據(jù)上述分析，其數(shù)學(xué)模型為式(1)。由數(shù)學(xué)模型可知，流量設(shè)定誤差校準不確定度的來源主要有流動相質(zhì)量 (W2-W1)、流動相的密度 (ρ)、時間 (t)、測量重復(fù)性 (rep)。其不確定度分量包括：u(W1)、u(W2)、u(ρ)、u(t)、u(rep)。

3.1 流量重復(fù)性引入的不確定度分量u(rep)

采用不確定評定A類方法對流量重復(fù)性分量進行評定，按式(1)計算流量Fm，重復(fù)測量3次，用極差法可簡單迅速算出標準偏差，一般在n<10時采用，根據(jù)極差法公式(5)計算出標準偏差為：

(5)

式中：xmax為同一設(shè)定流量3次測量值的最大值，mL/min；xmin為同一設(shè)定流量3次測量值的最小值，mL/min；dn為是極差系數(shù)，測量次數(shù)3時相應(yīng)的極差系數(shù)是1.69。

其平均標準偏差為：

流量重復(fù)性引入的不確定度分量：

3.2 稱量引入的不確定度分量u(w1)、u(w2)

采用不確定評定B類方法對稱量時所引入的W2、W1進行評定，天平最大允許誤差為0.01 mg，假設(shè)為均勻分布、則由稱量引入的不確定度分量為：

3.3 密度引入的不確定度分量

采用不確定評定B類方法對密度所引入的不確定度分量進行評定，密度最大允許誤差為1×10-6，因此，對密度引入的不確定度分量忽略不計[7]。

3.4 時間引入的不確定度分量

因儀器自動記錄收集時間，可以忽略。

3.5 標準合成不確定度

靈敏系數(shù)ci按式(6)計算：

ci=?f/?xi

(6)

根據(jù)數(shù)學(xué)模型各參數(shù)的靈敏系數(shù)為：

按B類方法評定的合成不確定度為：

將以上不確定度分量合成得到標準合成不確定度:

3.6 測量擴展不確定度

在最佳測量能力條件下，取包含因子k=2，則流量引用的擴展不確定度為：U=2×uc。

4 結(jié)論

隨著目前分析儀器行業(yè)飛速發(fā)展，這就要求檢定員在儀器檢定過程中不斷摸索改進，對現(xiàn)有方法進行補充完善，提高檢定規(guī)程/校準規(guī)范的可操作性。既要制定對新分析儀器的嚴謹科學(xué)的檢定校準方法又要盡量滿足客戶的需求，使檢定校準方法向著快捷、實用、科學(xué)的方向發(fā)展。本文提出了蛋白質(zhì)純化分析儀校準方法，能夠?qū)崿F(xiàn)泵系統(tǒng)的流量設(shè)定值誤差SS、流量穩(wěn)定性誤差SR、紫外-可見檢測器的基線噪聲和基線漂移、儀器整機性能的定性、定量測量重復(fù)性，儀器pH和電導(dǎo)率重復(fù)性等蛋白質(zhì)純化分析儀計量性能指標的綜合評價。依據(jù)本文提出的蛋白質(zhì)純化分析儀校準方法，筆者起草了中國計量科學(xué)研究院蛋白質(zhì)純化分析儀作業(yè)指導(dǎo)書，對外開展蛋白質(zhì)純化分析儀測試業(yè)務(wù)，先后在蛋白質(zhì)純化分析儀上進行了實驗，獲得了滿意的效果。

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[5] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.液相色譜儀檢定規(guī)程(JJG 705—2014).北京：中國質(zhì)檢出版社，2014

[6] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.電導(dǎo)率儀檢定規(guī)程(JJG 376—2007).北京：中國計量出版社，2008

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中國計量科學(xué)研究院國際比對專項(2013-25)

10.3969/j.issn.1000-0771.2015.07.14