李康 ，顏和芳 ，趙蔚 ，羅藝 ，徐文莉 ，廖長征 ，張洪德

(1、龍崗中心醫(yī)院，深圳 龍崗518116；2、寶安區(qū)慢性病防治院，深圳 寶安518126)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病，我國是HBV高流行區(qū)，約9.7%的人為HBV攜帶者[1]。乙型肝炎病毒(HBV)性傳播途徑已研究多年并被基本證實[2，3]，但既往研究主要基于宏觀流行病學(xué)研究和動物實驗，尚未找到人與人之間HBV性傳播的確切證據(jù)。近年來，隨著分子流行病學(xué)的發(fā)展，越來越多的傳染病傳播途徑通過分子進(jìn)化分析在分子水平得到證實[4]。本研究選擇疑似發(fā)生HBV性傳播的夫妻，使用基因序列比對及基因進(jìn)化樹分析等分子流行病學(xué)方法分析其所染HBV S基因，試圖從分子水平證實HBV存在性傳播途徑。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 從2010年來深圳市龍崗中心醫(yī)院體檢科做婚檢的夫妻中按照乙肝表面抗原結(jié)果篩選出女方陽性而男方陰性的夫妻36對，除5對男方注射乙肝疫苗而乙肝表面抗體陽性外，其余31對夫妻中男方乙肝兩對半均為全陰性。對這31名男性乙肝表面抗原每年隨訪檢測一次，至2014年，其中10名男性乙肝表面抗原由陰性變?yōu)殛栃?，且期間夫妻雙方均無輸血史。此10對夫妻作為病例組，女方使用一次性無菌采樣管采集陰道分泌物標(biāo)本，每管加入無菌生理鹽水1ml，震蕩混勻，分別標(biāo)記為W1-W10，-80℃保存；男方采集靜脈血分離血清，分別標(biāo)記為H1-H10，-80℃保存。另外隨機(jī)選擇10名來深圳市龍崗中心醫(yī)院感染科就診的血HBV-DNA陽性的男性乙型肝炎患者與上述10夫妻中女方隨機(jī)配對作為對照組，采集其靜脈血分離血清，分別標(biāo)記為U1-10，-80℃保存。病例組與對照組年齡、體重均無顯著性差異。

1.2 DNA提取 解凍陰道分泌物和血清標(biāo)本。陰道分泌物充分震蕩混勻后，吸取1ml至1.5ml離心管中，12000r/min離心5min，吸棄上清液，每管保留50μl上清液，勿觸及底部細(xì)胞團(tuán)，重新漩渦震蕩后備用。向50μl陰道分泌物、血清標(biāo)本中分別加入150μl含0.5%十二烷基磺酸鈉 (SDS)，1mg/ml蛋白酶 K，2.5mmol/l乙二胺四乙酸(EDTA)，25mmol/l醋酸鈉的裂解液，68℃裂解2h后，用苯酚、氯仿、異戊醇法提取HBV-DNA[5]。

1.3 基因測序及序列比對 針對乙肝病毒S基因設(shè)計巢式PCR引物。外引物1位于HBV基因序列的nt842-822(5’TTAGGGTTTAAATGTATACCC3’)，外引物 2 位于 nt56-76(5’CCTGCTGGTGGCTCCAGTTCC3’)，擴(kuò)增片 段 為 787bp。 內(nèi) 引 物 1位 于 nt427-448(5’CATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG3’)， 內(nèi) 引 物 2 位 于nt687-668(5’GGCACTAGTAAACTGAGCC3’)。 使用ABI7500 PCR儀進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，擴(kuò)增片段為261bp。第一輪PCR產(chǎn)物1:50稀釋后作為第二輪PCR的模板，每輪PCR均設(shè)置陽性、陰性對照，PCR方法參考王珊珊等報道[6]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司進(jìn)行高通量測序。使用DNAstar軟件包中的MegAlign軟件進(jìn)行多序列比對及基因進(jìn)化樹繪制[7]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料符合正態(tài)分布的采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，使用獨立樣本t檢驗對病例組和對照組的基因序列相似性進(jìn)行比較。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV S基因序列比對結(jié)果顯示病例組S基因序列相似性高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表 1。

表1 病例組與對照組HBV S基因序列相似性比較(s)

表1 病例組與對照組HBV S基因序列相似性比較(s)

組別 數(shù)量 序列相似性病例組對照組t值P值10 10 0.9961±0.0019 0.9774±0.0051 10.89<0.05

2.2 基因進(jìn)化樹分析 基因進(jìn)化樹顯示H3-W3，H5-W5，H6-W6，H7-W7，H9-W9 分別處于同一獨立遺傳分支，存在非常密切的同源進(jìn)化關(guān)系。H8-W8-U3，H10-W10-U5分別處于同一獨立遺傳分支，說明H8-W8，H10-W10存在較密切同源進(jìn)化關(guān)系，但其相互間序列相似性并不比無關(guān)感染者U3，U5 高。H1-W1，H2-W2，H4-W4 均不在同一獨立遺傳分支，同源進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。見圖1。

圖1 30例患者HBV S基因進(jìn)化樹分析

3 討論

近年來，隨著分子生物學(xué)和現(xiàn)代流行病學(xué)的飛速發(fā)展，乙型肝炎的流行病學(xué)研究已經(jīng)進(jìn)入了分子流行病學(xué)時代。使用基因序列差異評估，種系發(fā)育分析等分子流行病學(xué)手段，可在分子水平對乙型肝炎病毒的不同傳播途徑予以證實。

本研究中病例組女性選擇陰道分泌物標(biāo)本，巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示10名女性HBV-DNA均呈陽性，說明病例組女性患者陰道分泌物具有傳染性，具備通過性途徑傳播HBV的潛在可能。由于HBV的DNA聚合酶是一種反轉(zhuǎn)錄酶，缺少3′→5′核酸外切酶活性(此酶可切除不合理插入的核苷酸)，因而缺乏校正的功能，且HBV復(fù)制產(chǎn)量高，可達(dá)1012-1013病毒顆粒/天，因而導(dǎo)致HBV DNA復(fù)制中錯誤發(fā)生率遠(yuǎn)高于其他DNA病毒，約為每個位點每年核

苷酸替代率1.4~3.2×10-5[8-10]。如此高的錯誤發(fā)生率造成HBV的高變異率，也導(dǎo)致不同感染者體內(nèi)HBV-DNA序列存在一定差異，且序列差異隨著傳染距離的增長而增大。鑒于本研究病例組選擇為疑似性傳播病例，已基本排除男方由其他途徑感染HBV的可能，因此病例組中女方與其丈夫所感染HBV S基因序列相似性顯著高于病例組中女方與隨機(jī)選擇的無關(guān)男性乙肝患者HBV S基因序列相似性，可在分子水平證實病例組中男方所感染HBV由其配偶傳染而來。

對參與研究的30名患者HBV S基因序列做基因進(jìn)化樹分析進(jìn)一步揭示了病例組、對照組間HBV更為詳細(xì)的同源進(jìn)化關(guān)系。10對病例組中，有 5 對(H3-W3，H5-W5，H6-W6，H7-W7，H9-W9)處于同一個單獨的遺傳分支中，特別是H6-W6兩人HBV S基因序列完全相同，顯示出非常密切的同源進(jìn)化關(guān)系，證實這5對患者中，男方所染HBV由女方即其妻子傳播而來。H8-W8-U3，H10-W10-U5分別處于同一獨立遺傳分支，顯示出H8-W8，H10-W10間HBV較密切的同源進(jìn)化關(guān)系，但其相互間序列相似性并不比H8-U3，H10-U5高，說明 H8，H10所染 HBV可能由 W8，W10傳播而來，但幾率與從其他無關(guān)傳染源傳播而來無顯著差異。H1-W1，H2-W2，H4-W4雖然進(jìn)化距離較近但均不在同一獨立遺傳分支，其中H1與W7，H7在同一個獨立遺傳分支，W2與U7在同一個獨立遺傳分支，W4與U8，U9在一個獨立遺傳分支，說明H1-W1，H2-W2，H4-W4間HBV存在一定的同源進(jìn)化關(guān)系，但相互間同源進(jìn)化關(guān)系較H1-W7，W2-U7，W4-U8間同源進(jìn)化關(guān)系更遠(yuǎn)，故認(rèn)為H1，H2，H4 所染 HBV 可能不是從 W1，W2，W4 傳播而來。HBV S基因進(jìn)化樹分析進(jìn)一步從分子水平證實10對疑似性傳播HBV夫妻中5對存在夫妻間HBV傳播。

綜合序列比對和基因進(jìn)化樹分析結(jié)果，可以證實HBV存在夫妻間傳播，10對夫妻中，5對夫妻中男方所染HBV由女方傳播而來。鑒于本研究中女方選擇的標(biāo)本為陰道分泌物標(biāo)本，且既往研究也證實雖然HBV攜帶者唾液中可檢出HBVDNA[11-13]，但HBV并不通過共用餐具，擁抱，接吻，握手，咳嗽，噴嚏等途徑傳播[14，15]，因而排除了夫妻間通過其他非性途徑傳播的可能性，進(jìn)一步證實5對發(fā)生HBV夫妻間傳播的病例中男方所染HBV由女方通過性途徑傳播而來。從而最終從分子水平證實HBV可經(jīng)性途徑傳播。當(dāng)然本研究僅證實HBV感染女性可通過性途徑將HBV傳染給健康男性，男性HBV攜帶者是否也可將HBV通過性途徑傳染給女性或者男性性伴侶尚需要進(jìn)一步的深入研究來證實。

HBV的性傳播途徑雖早已通過大量流行病學(xué)研究及少量動物實驗獲得證實，但人與人之間HBV性傳播的直接證據(jù)卻一直難以獲得。本文使用分子流行病學(xué)方法首次在分子水平證實了人與人之間性傳播途徑的存在，顯示出基因序列比對，基因進(jìn)化樹分析等分子流行病學(xué)手段在研究傳染性疾病傳染源和傳播途徑方面的巨大價值，為大量已知傳染病傳染源和傳播途徑的精確分析和分子水平證實以及新發(fā)現(xiàn)傳染病傳染源與傳播途徑的快速確定提供了強(qiáng)大的研究工具。當(dāng)然此方法也存在一定的局限性。其主要局限性在于研究的病原體應(yīng)屬于變異率較高的高變異病原體，對于變異率較低的病原體，由于其不同感染者所帶病原體基因序列差異較小，是否能通過序列比對和基因進(jìn)化樹分析確定其傳染源和傳播途徑仍有待進(jìn)一步深入研究。

本研究從分子水平證實HBV存在性傳播途徑，可經(jīng)性途徑由女性傳染給男性。女性HBV感染者的健康性伴侶是HBV感染的高危人群，對此類高危人群的HBV預(yù)防不僅要及時接種乙肝疫苗并定期監(jiān)測乙肝表面抗體，還要加強(qiáng)安全性行為的教育，倡導(dǎo)使用避孕套，以阻斷HBV的性傳播途徑。

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