高強(qiáng) 馬春麗 張一娜 鄭秀海

腦白質(zhì)疏松與空間學(xué)習(xí)及記憶功能障礙關(guān)系的研究

高強(qiáng) 馬春麗 張一娜 鄭秀海

目的 探討腦白質(zhì)疏松與空間學(xué)習(xí)及記憶功能障礙的關(guān)系。 方法 將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=30)和模型組(n=30),通過結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈構(gòu)建腦白質(zhì)疏松模型,術(shù)前及術(shù)后3月分別進(jìn)行Morris水迷宮實驗,同時觀察腦白質(zhì)的組織學(xué)變化。 結(jié)果 定向航行階段,與假手術(shù)組相比,模型組尋找隱敝平臺能力下降(P<0.05),且于術(shù)后第2月開始出現(xiàn)(P<0.05),第3月改變明顯(P<0.01);空間探索階段,2組穿越次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);站臺周邊1路程顯示,模型組記憶能力較假手術(shù)組降低,此種改變于術(shù)后第3月出現(xiàn)(P<0.05)。模型組腦白質(zhì)病理改變顯示質(zhì)地疏松,出現(xiàn)大量空泡。 結(jié)論 腦白質(zhì)疏松出現(xiàn)一定時間之后可導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)及記憶障礙,并且空間學(xué)習(xí)能力受損早于記憶能力下降。

腦白質(zhì)疏松; 學(xué)習(xí)及記憶; Morris水迷宮實驗

腦白質(zhì)疏松(leukoaraiosis,LA)是一種年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性病變,影像學(xué)主要表現(xiàn)為腦室周圍、半卵圓中心斑點或斑片狀的改變,在核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)T2加權(quán)像上表現(xiàn)為白質(zhì)的高信號。目前,關(guān)于LA與認(rèn)知障礙的關(guān)系尚缺乏明確結(jié)論。國外研究發(fā)現(xiàn)腦容積降低與認(rèn)知功能障礙有關(guān)系[1];也有研究認(rèn)為顳葉萎縮與認(rèn)知功能障礙有關(guān)[2];Van等[3]認(rèn)為認(rèn)知功能下降與白質(zhì)病變關(guān)系密切。本研究應(yīng)用Morris水迷宮實驗結(jié)合腦室周圍白質(zhì)的組織學(xué)改變來探討LA對大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用2～3月齡健康SD雄性大鼠60只,體質(zhì)量200～250 g,由黑龍江省哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實驗動物中心提供[許可證號:SCXK(黑)2013-001]。

1.2 方法

1.2.1 動物分組:采用隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分為假手術(shù)組(n=30)和模型組(n=30)。組間鼠齡、體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。2組觀察至術(shù)后3月。造模前及造模后每月均進(jìn)行水迷宮實驗,共4次。每次實驗前均從各組隨機(jī)抽取5只大鼠斷頭取腦進(jìn)行組織學(xué)觀察。將最終剩余10只大鼠的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.2 動物模型的制備:本研究采用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈 (2-VO)法,制作LA動物模型。大鼠術(shù)前禁食12 h、禁水6 h。10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉,仰臥固定,頸前部去毛,碘酒消毒后,沿腹側(cè)頸正中切開,依次剪開筋膜,分離肌肉后從氣管旁游離出雙側(cè)頸總動脈,以0-4號線分別結(jié)扎頸總動脈近心端和遠(yuǎn)心端后,將其剪斷以確保無血流通過。假手術(shù)組動物操作同前,分離但不結(jié)扎頸總動脈。

1.2.3 實驗裝置:水迷宮分析系統(tǒng)BW-MWM101由上海軟隆科技發(fā)展有限公司提供。水迷宮實驗按照Patil等[4]和Sase等[5]所述進(jìn)行操作。實驗的設(shè)備包括圓形水池,登陸平臺,圖像采集系統(tǒng)(包括電腦、攝像機(jī)、廣角變焦透鏡、圖像采集芯片和顯示器)和數(shù)據(jù)收集、分析軟件。水池直徑180 cm,高60 cm,內(nèi)壁為黑色,將水池分為4個象限,池壁上依次標(biāo)上N、E、S、W字母,任選一象限放置平臺(平臺與圓心和池壁等距,本實驗為第4象限)。平臺呈圓柱形,高40 cm,直徑為10 cm。測試前用黑色食用色素將水染黑,水變得不透明,這樣一方面有利于捕捉信號,另一方面食用色素?zé)o毒,水不易變質(zhì),且不造成大鼠染色。將水放到高出平臺1 cm即可,使平臺位于水下,排除了大鼠看到平臺的可能。水溫保持在22 ℃～24 ℃之間,以免引起大鼠不適,干擾實驗結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo) 學(xué)習(xí)記憶能力的測定:大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力測試Morris水迷宮實驗分為2部分:(1)定位航行實驗:用于測量大鼠對水迷宮學(xué)習(xí)的獲取能力。實驗歷時6 d。實驗前讓大鼠在水中自由游泳2 min,以適應(yīng)水中的活動。從第2天起,每天上午固定時間進(jìn)行訓(xùn)練,保持周圍環(huán)境安靜,實驗人員不要隨意走動,盡可能將室內(nèi)燈光關(guān)閉,利用自然光線。每天訓(xùn)練4次,每次間隔15～20 min。訓(xùn)練時隨機(jī)選擇一個入水點(避免大鼠同一入水點入水),將大鼠面向池壁放入水中,記錄大鼠尋找并爬上平臺所需的時間(即潛伏期)及游泳路線。每次訓(xùn)練時間為60 s,如果大鼠在60 s內(nèi)未找到平臺,須將其引至平臺,這時潛伏期記為60 s。(2)空間探索實驗:用于測量大鼠學(xué)會尋找平臺后,對平臺空間位置記憶的保持能力。在第6天撤除水下平臺,隨機(jī)選取入水點(平臺所在象限的對側(cè))將大鼠面向池壁放入水中,測其在60 s內(nèi)跨過原平臺相應(yīng)位置的次數(shù)及站臺周邊1的路程。

1.4 灌注取腦 灌注方法如下:以胸骨最下端劍突處為出發(fā)點,向左右兩側(cè)剪開皮膚、肌肉等組織,進(jìn)入腹腔。將腹部臟器撥向一邊,即可看見腹主動脈,止血鉗夾閉后,剪破膈肌進(jìn)入胸腔。充分暴露心臟,在心尖偏左的位置進(jìn)入穿刺針,固定后,剪開右心耳,生理鹽水灌注,約200 ml后改為4%多聚甲醛繼續(xù)灌注,待大鼠上肢及頸部變硬停止灌注。斷頭取腦,甲醛繼續(xù)固定24 h。以視交叉層面為起始,止于視神經(jīng)發(fā)出層面,用于觀察腦室周圍白質(zhì)。然后沖洗,梯度酒精脫水,二甲苯透明,再浸蠟包埋,片厚4 μm。用于常規(guī)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SAS 9.1.3版統(tǒng)計軟件,作圖用的軟件是Graphpad Prism 5.0,所有數(shù)值型連續(xù)變量的分析采用重復(fù)測量方差分析(ANOVA for repeated measurement),P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠造模后的改變 大鼠在動脈結(jié)扎后可見雙側(cè)眼裂明顯變小。與假手術(shù)組相比,行動遲緩,進(jìn)食減少,但在1周內(nèi)均恢復(fù)正常。

2.2 2組第4象限路程百分比比較 假手術(shù)組在第4象限的路程逐漸增加,模型組除最后1月略有減少外其余呈增加趨勢。同組內(nèi)術(shù)后不同時間點與術(shù)前比較:假手術(shù)組術(shù)后各月均較術(shù)前顯著增加(P<0.01)。模型組術(shù)后第1月與術(shù)前比較無變化(P=0.275),術(shù)后第2月及第3月較術(shù)前均明顯增加(P<0.001)。同一時間點組間比較,術(shù)前及術(shù)后第1月2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.192,P=0.097),術(shù)后第2月模型組較假手術(shù)組第4象限路程開始減少(P<0.05),術(shù)后第3月減少顯著(P<0.01)。見表1。

表1 2組第4象限路程百分比的比較

注:與同時間假手術(shù)組比較,*P<0.05;與同組術(shù)前比較,△P<0.05

2.3 2組潛伏期比較 除術(shù)后第3月外,2組潛伏期均隨時間延長而逐漸縮短。同組內(nèi)術(shù)后各月與術(shù)前比較:2組潛伏期均較術(shù)前明顯縮短(P<0.01)。同一時間點組間比較:術(shù)前及術(shù)后第1月2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.146,P=0.062);模型組術(shù)后第2月及第3月較假手術(shù)組潛伏期延長(P<0.05)。見表2。

表2 2組潛伏期的比較

注:與同時間假手術(shù)組比較,*P<0.05;與同組術(shù)前比較,△P<0.05

2.4 2組穿越次數(shù)比較 撤去平臺后,模型組除術(shù)后第1月穿越次數(shù)較術(shù)前增加,其余月份與術(shù)前比較改變不明顯。假手術(shù)組術(shù)后均比術(shù)前穿越次數(shù)增加。但2組間無論是同組不同時間點還是同時間點不同組間的比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 2組穿越次數(shù)的比較次，n=10)

2.5 2組站臺周邊1路程(與站臺距離小于水池半徑1/4的區(qū)域)比較 模型組整體呈下降趨勢。假手術(shù)組除術(shù)后第3月外呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。同組不同時間點比較:與術(shù)前相比,假手術(shù)組術(shù)后站臺周邊1路程明顯增加(P<0.01);模型組則無變化(P>0.05)。同一時間2組間的比較顯示:術(shù)前及術(shù)后第1、2月均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);術(shù)后第3月模型組站臺周邊1路程比假手術(shù)組減少(P<0.05)。見表4。

表4 2組站臺周邊1路程的比較

注:與同時間假手術(shù)組比較,*P<0.05;與同組術(shù)前比較,△P<0.05

2.6 LA的病理改變 大鼠腦組織HE染色可見，假手術(shù)組各時間點組織學(xué)改變無明顯差異,腦室周圍白質(zhì)組織結(jié)構(gòu)緊密,血管間隙正常,未見明顯疏松。模型組術(shù)前與假手術(shù)組差異不大,雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎術(shù)后第1月:腦室周圍白質(zhì)小范圍組織密度降低,出現(xiàn)少量空泡,同時可見增大的血管間隙;第2月:白質(zhì)病變范圍增大密度降低較前明顯,空泡增多；第3月:白質(zhì)出現(xiàn)大量的空泡,組織質(zhì)地稀疏。見圖1。

注:A:假手術(shù)組；B：術(shù)后第1月；C：術(shù)后第2月；D：術(shù)后第3月圖1 腦室周圍白質(zhì)

3 討論

認(rèn)知是人腦接受外界信息,經(jīng)過加工處理,轉(zhuǎn)換成內(nèi)在的心理活動,從而獲取知識或應(yīng)用知識的過程,包括記憶、語言、視空間、執(zhí)行、計算和理解判斷等多方面內(nèi)容。本研究主要檢測大鼠的學(xué)習(xí)及記憶功能,而水迷宮實驗定向航行和空間探索正是反映了大鼠的這2種功能,即逃逸潛伏期可以檢測獲取空間信息的能力,而探索過程主要反映記憶儲存及提取再現(xiàn)能力。

腦白質(zhì)病變是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種常見的影像學(xué)改變,尤其在老年人群中發(fā)生率約為60%～90%,盡管對于腦白質(zhì)病變的研究越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視,但是其與學(xué)習(xí)、記憶的關(guān)系尚無明確結(jié)論[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn),LA確與空間學(xué)習(xí)及記憶障礙有關(guān),但這種障礙并不是突然出現(xiàn),而是一個逐漸加重的過程。在水迷宮實驗中,通過定位航行訓(xùn)練,隨著時間推移大鼠尋找隱蔽平臺的能力逐漸增強(qiáng),目標(biāo)象限路程百分比逐漸增加,潛伏期逐漸縮短。這說明通過訓(xùn)練,2組大鼠空間定位能力均得到提高。但術(shù)后相同時間點2組的比較顯示,模型組在術(shù)后第1月同假手術(shù)組相比結(jié)果無差異,且同術(shù)前相比也無明顯差異,但是在術(shù)后第2月假手術(shù)組結(jié)果開始優(yōu)于模型組,術(shù)后第3月2組差異更顯著,這說明空間學(xué)習(xí)能力受損并不是術(shù)后馬上出現(xiàn),而是一個隨時間積累逐漸加重的過程?？臻g探索實驗結(jié)果中2組穿越次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但對站臺周邊1路程結(jié)果分析,2組有統(tǒng)計學(xué)差異,這說明假手術(shù)組在撤去平臺后記憶能力隨著實驗次數(shù)的增加顯著增強(qiáng),而模型組記憶能力受損,于術(shù)后第3月開始出現(xiàn)。由此我們可以得出腦缺血可導(dǎo)致LA,在出現(xiàn)LA的初期,空間學(xué)習(xí)及記憶功能受損并不明顯,隨著LA時間的延長,有害因素的累積,認(rèn)知障礙才逐漸出現(xiàn),并且以空間學(xué)習(xí)能力受損較為顯著,記憶能力的損害相對較輕為其特點。同時,本實驗中同一批大鼠多次進(jìn)行水迷宮實驗,從所得結(jié)果可以看出反復(fù)的記憶訓(xùn)練可以減輕及減緩學(xué)習(xí)記憶功能的損害。國外研究也發(fā)現(xiàn)LA在認(rèn)知功能下降之前就已經(jīng)出現(xiàn)[8],同時導(dǎo)致認(rèn)知功能損害的白質(zhì)病變需要達(dá)到一定的閾值[9],才能出現(xiàn)臨床癥狀。這一結(jié)論也在本研究中得到證實。

腦室周圍白質(zhì)與認(rèn)知功能關(guān)系較為密切,而皮層下白質(zhì)損害相對不重要,在前瞻性人群隊列研究中發(fā)現(xiàn)腦室旁白質(zhì)損害越嚴(yán)重,癡呆發(fā)病風(fēng)險越高,而皮層下白質(zhì)損害與癡呆發(fā)病關(guān)系不明顯。白質(zhì)病變導(dǎo)致學(xué)習(xí)及記憶障礙也是由其功能決定的。腦白質(zhì)主要由神經(jīng)纖維軸突與膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成,是信息傳遞的重要通路,其中與記憶、情緒、行為等認(rèn)知功能活動有關(guān)的纖維聯(lián)系分別通過腦室周圍形成多種邊緣環(huán)路與灰質(zhì)相連,而白質(zhì)較灰質(zhì)更不耐受缺血。因此當(dāng)缺血發(fā)生時,由于腦室旁白質(zhì)病變范圍是責(zé)任血管的“遠(yuǎn)端供血區(qū)”,即動脈供血的分水嶺區(qū);同時供血動脈缺少側(cè)支循環(huán)或缺如,因此引起神經(jīng)纖維脫髓鞘，使白質(zhì)與皮質(zhì)之間的聯(lián)系纖維中斷,進(jìn)而導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶功能障礙。本研究證明當(dāng)缺血發(fā)生1月時白質(zhì)就已經(jīng)有了脫髓鞘的改變。而相關(guān)研究通過電鏡觀察同樣證實在缺血20 d胼胝體和內(nèi)囊有髓纖維髓鞘變形、板層結(jié)構(gòu)疏松、崩潰,血管旁水腫[10]。但是缺血初期受損的神經(jīng)纖維數(shù)量相對較少,信息傳遞受到的影響不明顯。隨著缺血時間延長,腦室周圍白質(zhì)受累面積增大,脫髓鞘明顯,空泡增多,導(dǎo)致大量組織疏松。同時皮層神經(jīng)元出現(xiàn)大量凋亡，于是學(xué)習(xí)及記憶功能受累,出現(xiàn)臨床癥狀。

綜上所述,LA與空間學(xué)習(xí)及記憶障礙有關(guān)。早期對其進(jìn)行干預(yù)可以減慢病情的發(fā)展,減輕患者認(rèn)知功能的損害。

[1] Shenkin SD, Bastin ME, Macgillivray TJ, et al. Cognitive correlates of cerebral white matter lesions and water diffusion tensor parameters in community-dwelling older people[J]. Cerebrovasc Dis, 2005,20(5):310-318.

[2] Firbank MJ, Burton EJ, Barber R, et al. Medial temporal atrophy rather than white matter hyperintensities predict cognitive decline in stroke survivors[J]. Neurobiol Aging, 2007, 28(11):1664-1669.

[3] Van Dijk EJ, Prins ND, Vrooman HA, et al. Progression of cerebral small vessel disease in relation to risk factors and cognitive consequences: Rotterdam Scan Study[J]. Stroke, 2008,39(10):2712-2719.

[4] Patil SS, Sunyer B, H?ger H, et al. Evaluation of spatial memory of C57BL/6J and CD1 mice in the Barnes maze, the Multiple T-maze and in the Morris water maze[J]. Behav Brain Res, 2009,198(1):58-68.

[5] Sase A, Khan D, H?ger H, et al. Intraperitoneal injection of saline modulates hippocampal brain receptor complex levels but does not impair performance in the Morris Water Maze[J]. Amino Acids, 2012,43(2):783-792.

[6] Schenk C, Wuerz T, Lerner AJ. Small vessel disease and memory loss: what the clinician needs to know to preserve patients’ brain health[J]. Curr Cardiol Rep, 2013,15(12):427.

[7] Grueter BE, Schulz UG. Age-related cerebral white matter disease (leukoaraiosis): a review[J]. Postgrad Med J, 2012,88(1036):79-87.

[8] Schmidt R, Petrovic K, Ropele S, et al. Progression of leukoaraiosis and Cognition[J]. Stroke, 2007,38(9):2619-2625.

[9] Pantoni L, Poqqesi A, Basile AM, et al. Leukoaraiosis predicts hidden global functioning impairment in nondisabled older people: the LADIS (Leukoaraiosis and Disability in the Elderly) Study[J]. J AM Geriatr Soc, 2006,54(7):1095-1101.

[10]葉欽勇,詹增土,鄭安,等. 慢性全腦低灌注大鼠側(cè)腦室旁白質(zhì)改變及其與基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的關(guān)系[J].中華老年醫(yī)學(xué)雜志, 2013,32(2):215-218.

Association of leukoaraiosis with spatial learning and memory dysfunction

GAOQiang,MAChun-li,ZHANGYi-na,ZHENGXiu-hai.DepartmentofGeriatics,theSecondAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150086,China

Objective To investigate the association of leukoaraiosis with spatial learning and memory dysfunction. Methods Sixty male SD rats were randomly divided into sham group and model group with 30 rats in each group. Leukoaraiosis model was constructed by bilateral carotid artery ligation. The rats should undergo Morris water maze test for 4 times. Histological changes of the white matter were observed. Results In directional navigation phase,compared with the sham group, learning ability of model group decreased (P<0.05)which began from the second month (P<0.05), and decreased significantly in the third month (P<0.01). In space exploration phase,crossing times of the two groups were of no difference (P>0.05).The data of platform peripheral 1 indicated that memory platform was significantly enhanced in sham group (P<0.01),but weakened in model group. Memory impairment of model group appeared in the third month. Pathology in the model group showed that white matter density decreased and vacuoles appeared. Conclusions Leukoaraiosis could lead to spatial learning and memory disorders. The impairment of spatial learning appeared earlier than memory decline.

leukoaraiosis; learning and memory; morris water maze test

黑龍江省衛(wèi)生廳基金資助項目(2014-313)

150086黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院老年病科

R 749.1

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.11.008

2014-12-30)