王會(huì)敏，何柯新，徐建華，尚陳宇，周克元

(1.廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣州 510120；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510370；3.廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所,廣東湛江 524023)

·論著·

利用RNAi阻抑hTERT和Bi-1雙基因表達(dá)的RNAi作用效果的研究**

王會(huì)敏1，何柯新2，徐建華1，尚陳宇1，周克元3△

(1.廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣州 510120；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510370；3.廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所,廣東湛江 524023)

目的 利用LipofectamineTM2000將針對(duì)靶向人類端粒酶末端逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和Bax inhibitor-1(Bi-1)基因設(shè)計(jì)并構(gòu)建的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染至CNE-2Z鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)序列特異性的基因沉默，研究其產(chǎn)生的shRNA阻抑hTERT和Bi-1基因表達(dá)的效果。方法 收集CNE-2Z細(xì)胞，設(shè)未處理組、pEGFP-N1組、pEGFP-N1/Lip組，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Lip對(duì)CNE-2Z細(xì)胞的轉(zhuǎn)染能力，RT-PCR和Western blot法分析表達(dá)shRNA重組質(zhì)粒載體對(duì)hTERT和Bi-1基因mRNA表達(dá)的抑制效應(yīng)。結(jié)果 轉(zhuǎn)染CNE-2Z細(xì)胞的質(zhì)粒和Lip最佳組合：質(zhì)粒為2.5 μg，Lip為6.25 μL。結(jié)論 成功構(gòu)建的針對(duì)人hTERT和Bi-1基因的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒能特異、有效地阻抑hTERT和Bi-1基因的表達(dá)。

人類端粒酶末端逆轉(zhuǎn)錄酶；bax inhibitor-1；RNA干擾

眾所周知，鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展并不是由單一因素引起的，所以，單單沉默一個(gè)基因或沉默一個(gè)基因的某個(gè)片段不足以完全敲除所有的致病基因，故需要對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行敲除。本研究擬將前期[1]已成功構(gòu)建的靶向人類端粒酶末端逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriplase，hTERT)和Bax inhibitor-1(Bi-1)的siRNA雙基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z，以期在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)針對(duì)hTERT和Bi-1雙基因的shRNAs，進(jìn)而產(chǎn)生RNAi效應(yīng)并特異地阻抑hTERT和Bi-1基因的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 FluorChem SP熒光化學(xué)發(fā)光凝膠圖像分析系統(tǒng)購自Alpha Innotech公司；ABI PRISM 7300熒光定量PCR儀購自Applied Biosystems公司；Epics-XL型流式細(xì)胞儀購自美國Coulter公司；TC 2323型CO2孵箱購自美國SHELLAB公司；Mini-PROTEIN Ⅱ Electrophoresis Cell和電泳轉(zhuǎn)移槽購自BIO-RAD公司。

1.1.2 試劑 鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z、真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)和綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1由廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所提供；KpnⅠ、EcoRⅠ、NotⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、One Step SYBR PrimeScriptTMTR-PCR Kit購自寶生物公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；Western blot相關(guān)試劑購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將CNE-2Z細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%滅活小牛血清、1.0×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底，棄去培養(yǎng)液。以PBS液沖洗2次，加入0.25%胰蛋白酶消化至貼壁細(xì)胞逐漸趨于圓形時(shí)倒掉消化液，PBS液沖洗，加入RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化。制成懸液，分為2～3瓶，置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以每孔4.0×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板。每孔加入2 mL培養(yǎng)基，置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度約95%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

1.2.2 篩選pEGFP-N1與Lip的最佳作用比例 設(shè)未處理組、pEGFP-N1組、pEGFP-N1/Lip組(pEGFP-N1質(zhì)粒與Lip之比值分別為1∶0.5、1∶1.5、1∶2.5、1∶3.5、1∶4.5，其中Lip加2.0 μL)。先將Lip用無抗菌藥物無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，輕搖混合，室溫放置5 min后，加入用無抗菌藥物無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋的pEGFP-N1質(zhì)粒管中，輕搖混合，室溫放置20 min，逐滴加入已接種細(xì)胞的6孔板中。轉(zhuǎn)染后5 h換為含1×105U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素，10%新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，用PBS液洗細(xì)胞3次。流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 篩選出pEGFP-N1與Lip的最佳作用濃度 設(shè)未處理組、pEGFP-N1與Lip組(pEGFP-N1 4.00 μg、Lip 10.00 μL；pEGFP-N1 3.50 μg、Lip 8.75 μL；pEGFP-N1 3.00 μg、Lip 7.50 μL；pEGFP-N1 2.50 μg、Lip 6.25 μL；pEGFP-N1 2.00 μg、Lip 5.00 μL；pEGFP-N1 1.50 μg、Lip 2.00 μL；其中，pEGFP-N1與Lip比例為1∶2.5)。轉(zhuǎn)染時(shí)，用無血清無抗菌藥物的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒與Lip，處理細(xì)胞48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，用PBS液洗細(xì)胞3次。流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)干擾質(zhì)粒阻抑hTERT和Bi-1 mRNA表達(dá)情況 提取RNA測(cè)定A260和A280并計(jì)算RNA含量，分裝，置-70 ℃?zhèn)溆?。參照寶生物公司的One Step SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit說明書進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，各基因的引物設(shè)計(jì)，Beta actin上游引物：5′-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3′,下游引物：5′-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3′；hTERT上游引物：5′-GAG TGT CTG GAG CAA GTT GCA AAG-3′，下游引物：5′-CAC GAC GTA GTC CAT GTT CAC AAT C-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度187 bp；Bi-1上游引物：5′-ATC ATT GTA ACC AAT CCT GCC AGA C-3′，下游引物：5′-AGC CTC GCT CTG TTG ATG TGA A-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度137 bp。按20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行，Total RNA 2 μL，RNase Free dH2O 6 μL，2×One Step SYBR RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL，上下游引物、TaKaRa Ex TaqTMHS(5 U/μL)、PrimeScriptTMRT Enzyme MixⅡ和ROX Reference Dye or Dye Ⅱ (50×)各0.4 μL，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。反應(yīng)條件見圖1，反應(yīng)結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用系統(tǒng)自帶的SDS軟件(v 1.4)進(jìn)行分析。相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)使用的分析方法為比較Ct值法。Ct值表示閾值循環(huán)，是熒光信號(hào)強(qiáng)度超過設(shè)置的閾值強(qiáng)度時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。因?yàn)镃t值與反應(yīng)管中模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性對(duì)應(yīng)關(guān)系，根據(jù)公式：△△Ct=[CthTERT/Bi-1-Ctβ-actin]實(shí)驗(yàn)組樣品-[CthTERT/Bi-1-Ctβ-actin]空白組樣品[2]，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組樣品相對(duì)于空白組樣品中hTERT或/Bi-1基因的表達(dá)量2-△△Ct。

1.3 Western-blot檢測(cè)各重組質(zhì)粒阻抑CNE-2Z細(xì)胞中hTERT和Bi-1蛋白表達(dá)情況 按照碧云天生物技術(shù)研究所Western及IP細(xì)胞裂解液說明書上的步驟提取總蛋白并做蛋白定量。制備分離膠和濃縮膠，按凝膠大于VDF膜大于濾紙的順序，凝膠側(cè)陰極，PVDF膜側(cè)陽極連接好電極進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。加上預(yù)冷的電轉(zhuǎn)移緩沖液，于0 ℃冰箱中進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，恒流90 mA，轉(zhuǎn)移12～16 h(Bi-1)或恒流200 mA，轉(zhuǎn)移0.75 h(β-actin)或恒流200 mA，轉(zhuǎn)移3 h(hTERT)。取出轉(zhuǎn)移好的PVDF膜，TBS洗10 min，將PVDF膜轉(zhuǎn)至塑料袋中，加入封閉液室溫封閉3～5 h。再加入抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。于暗室中顯影并用Bandscan圖像分析軟件進(jìn)行光密度積分值(integral of optical density)分析。以hTERT或Bi-1與β-actin(內(nèi)參照)的光密度積分值之比作為各目的蛋白的相對(duì)含量值。

圖1 RT-PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化 通過流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)綠色熒光細(xì)胞的量及熒光強(qiáng)度，確定最佳轉(zhuǎn)染條件。FCM結(jié)果表明,未處理組、pEGFP-N1組、Lip組、EGFP-N1/Lip組(pEGFP-N1質(zhì)粒與Lip之比值分別為1∶0.5、1∶1.5、1∶2.5、1∶3.5、1∶4.5，其中，Lip加2.0 μL時(shí))，Lip對(duì)CNE-2Z細(xì)胞的轉(zhuǎn)染能力分別為(0.75±0.03)%、(0.81±0.02)%、(0.76±0.04)%、(18.6±1.28)%、(23.5±1.09)%、(30.4±2.12)%、(26.3±1.89)%、(28.7±1.53)%，結(jié)果見圖2。

表1 各實(shí)驗(yàn)組hTERT和Bi-1的相對(duì)表達(dá)量(n=3)

*:P<0.01。

1:未處理組；2:pEGFP-N1組；3:Lip組;4：pEGFP-N1/Lip:1∶0.5組；5：pEGFP-N1/Lip:1∶1.5組；6：pEGFP-N1/Lip:1∶2.5組；7：pEGFP-N1/Lip:1∶3.5組；8:pEGFP-N1/Lip:1∶4.5組。與未處理組和pEGFP-N1組比較,n=3,**:P<0.01。

圖2 Lip介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后CNE-2Z細(xì)胞表達(dá)GFP的情況(GFP與Lip不同比例)

1：未處理組；2：pEGFP-N1 4.00 μg，Lip 10.00 μL組；3：pEGFP-N1 3.50 μg，Lip 8.75 μL組；4：pEGFP-N1 3.00 μg，Lip 7.50 μL組；5：pEGFP-N1 2.50 μg，Lip 6.25 μL組；6：pEGFP-N1 2.00 μg，Lip 5.00 μL組；7：pEGFP-N1 1.50 μg，Lip 2.00 μL組。與未處理組和pEGFP-N1組比較,n=3,**:P<0.01。

圖3 Lip介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后CNE-2Z細(xì)胞表達(dá)GFP的情況(GFP與Lip不同濃度)

A：hTERT的溶解曲線；B：測(cè)hTERT時(shí)β-actin的溶解曲線；C：Bi-1的溶解曲線；D：測(cè)Bi-1時(shí)β-actin的溶解曲線。

圖4 RT-PCR中hTERT和Bi-1引物的特異性

未處理組、pEGFP-N1組與Lip組(pEGFP-N1 4.00 μg，Lip 10.00 μL；pEGFP-N1 3.50 μg，Lip 8.75 μL；pEGFP-N1 3.00 μg，Lip 7.50 μL；pEGFP-N1 2.50 μg，Lip 6.25 μL；pEGFP-N1 2.00 μg，Lip 5.00 μL；pEGFP-N1 1.50 μg，Lip 2.00 μL；其中，pEGFP-N1與Lip比例為1∶2.5時(shí))，Lip對(duì)CNE-2Z細(xì)胞的轉(zhuǎn)染能力分別為(1.53±0.23)%、(37.5±2.20)%、(35.7±5.2)%、(40.3±3.89)%、(48.5±5.80)%、(37.7±9.20)%、(45.2±2.70)%，結(jié)果見圖3。未處理組和pEGFP-N1對(duì)照組的綠色熒光細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及熒光強(qiáng)度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各經(jīng)處理過的pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組與未處理組和pEGFP-N1對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中，pEGFP-N1為2.5 μg，Lip為6.25 μL時(shí)，轉(zhuǎn)染率最高，達(dá)48.5%，提示shRNA表達(dá)質(zhì)粒在Lip的介導(dǎo)下能較好地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)。

2.2 RT-PCR結(jié)果 RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后，目的基因和內(nèi)參的溶解曲線顯示，4個(gè)曲線都只有單一的峰(圖4)，說明所設(shè)計(jì)的引物有較高特異性，只擴(kuò)增出單一產(chǎn)物。設(shè)置由系統(tǒng)自動(dòng)調(diào)整基線和閾值，以未進(jìn)行任何處理的CNE-2Z細(xì)胞為空白組樣品，計(jì)算出各個(gè)實(shí)驗(yàn)組樣品相對(duì)于空白組樣品的TERT和(或)Bi-1表達(dá)量(2-△△Ct)，再取其對(duì)數(shù)，比較各實(shí)驗(yàn)組樣品中TERT和Bi-1水平的差異。結(jié)果如表1所示，Lip對(duì)照組和pcDNA3.1(+)/Lip對(duì)照組及亂碼/Lip組與未處理組比較，細(xì)胞中TERT和(或)Bi-1基因的mRNA表達(dá)水平基本上趨于一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TR//Lip組、Bi-1/Lip組和TR-Bi-1/Lip組與所有對(duì)照組比較，細(xì)胞中TERT和(或)Bi-1基因的mRNA表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，前二者同后者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在CNE-2Z細(xì)胞中，干擾質(zhì)粒TR/Lip組、Bi-1/Lip組和TR-Bi-1/Lip組與未處理組比較，hTERT和(或)Bi-1的蛋白表達(dá)水平均下調(diào)。其中，TR/Lip組和TR-Bi-1/Lip組中hTERT蛋白的下調(diào)率分別為67%和70%，Bi-1/Lip組和TR-Bi-1/Lip組中Bi-1蛋白的下調(diào)率分別為75%和69%，提示構(gòu)建的RNA干擾載體均能預(yù)期下調(diào)目的蛋白，尤其是TR-Bi-1/Lip組，同時(shí)下調(diào)了hTERT和Bi-1兩種蛋白。

3 討論

RNAi是由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)所引發(fā)的靶基因mRNA降解而導(dǎo)致的序列特異性基因沉默。自然界中存在著另一類RNA即miRNA，它與siRNA有一些相似性，都是由大約22個(gè)核苷酸組成，都能被Dicer所識(shí)別，且都可發(fā)揮RNAi的效果，不同的是miRNA被Dicer切割后有2種結(jié)果，當(dāng)miRNA與要沉默基因的mRNA完全或近乎完全配對(duì)時(shí)會(huì)裂解靶基因的mRNA，但是，大多數(shù)的miRNA會(huì)與mRNA的3′非編碼區(qū)(3′UTR)結(jié)合從而抑制翻譯的進(jìn)行[3-5]。本研究利用miR-30的基本骨架，用靶基因序列代替miR-30的中間部分，這樣既可以使其被Dicer所識(shí)別，又因其與靶基因的mRNA完全配對(duì)而裂解靶基因。

hTERT定位于染色體5p15.33，是一個(gè)單拷貝基因，其長(zhǎng)度為4 030 bp，含有16個(gè)外顯子和15個(gè)內(nèi)含子，蛋白質(zhì)由1 132個(gè)氨基酸殘基組成[6]。hTERT被普遍認(rèn)為是端粒酶的催化亞單位，該基因的表達(dá)與人端粒酶的激活密切相關(guān)。越來越多的研究表明，抑制端粒酶的活性可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制，最終走向凋亡[7-8]。Bi-1是一個(gè)廣泛存在于真核生物、原核生物和病毒中的保守性基因，定位于大鼠的7號(hào)染色體、小鼠的15號(hào)染色體、人的12號(hào)染色體[9]。Bi-1是近年發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制因子，主要通過抑制線粒體相關(guān)的凋亡途徑阻斷細(xì)胞凋亡過程[10-11]，受bcl-2和bax的調(diào)控，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。

為了獲得較高的轉(zhuǎn)染效率和較低的非特異性效應(yīng)，本研究在確保細(xì)胞具有95%匯合度(有助于減小陽離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性對(duì)細(xì)胞的影響)的前提下，進(jìn)行轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的RNA干擾質(zhì)粒缺乏熒光蛋白的表達(dá)構(gòu)件，無法直接檢測(cè)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染率；pEGFP-N1質(zhì)粒含有綠色熒光蛋白表達(dá)構(gòu)件，且該質(zhì)粒大小為4 733 bp，與本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的RNA干擾質(zhì)粒大小(5 470 bp、5 501 bp及5 543 bp)相近，并且其同所構(gòu)建的載體同屬于含RNA聚合酶Ⅱ類啟動(dòng)子的載體，可作為檢測(cè)干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的參考物。最終確定了轉(zhuǎn)染CNE-2Z細(xì)胞的質(zhì)粒和Lip最佳組合：質(zhì)粒為2.5 μg，Lip為6.25 μL(6孔板)。

RNAi效率與細(xì)胞類型、轉(zhuǎn)染時(shí)間、轉(zhuǎn)染效率、siRNA序列及濃度等有密切關(guān)系，而高效轉(zhuǎn)染率可增加基因表達(dá)阻抑的可能性[12-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑具有較高的轉(zhuǎn)染效率(在CNE-2Z中的轉(zhuǎn)染率在40%以上)，故選用其進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)將所構(gòu)建的雙基因表達(dá)載體與單基因表達(dá)載體相比較，看其是否能同時(shí)沉默2種基因。RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明，雙基因沉默組中的hTERT和(或)Bi-1mRNA的相對(duì)含量與單基因沉默組相同，都比對(duì)照組降低，前者同后二者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Western blot結(jié)果也顯示雙基因沉默組中的hTERT和(或)Bi-1蛋白的相對(duì)含量與單基因沉默組相同，比對(duì)照組降低，前者同后二者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，載體上的2個(gè)shRNA相互之間沒有發(fā)生拮抗作用，同時(shí)也說明了所構(gòu)建的雙基因表達(dá)載體的成功與有效性。

[1]王會(huì)敏,周克元.靶向hTERT和Bax inhibitor-1的siRNA雙基因表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定[C].細(xì)胞·生命·健康——第十一屆中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)暨2009西安細(xì)胞生物學(xué)國際會(huì)議論文集，2009.

[2]林東子,張志珍,梁念慈.H9N2亞型禽流感病毒ns1基因克隆[J].廣東醫(yī)學(xué),2006,27(12):1791-1792.

[3]Baga S,Brancht J,Hunter S,et al.Regulation by let-7 and lin-4 miRNAs results in target mRNA degradation[J].Cell,2005,122(4):553-563.

[4]Petersen CP,Bordeleau ME,Pelletier J,et al.Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells[J].Molecular Cell,2006,21(4):533-542.

[5]Jing Q,Huang S,Guth S,et al.Involvement of microRNA in AU-rich element-mediated mRNA instability[J].Cell,2005,120(5):623-634.

[6]Meyerson M,Counter CM,Eaton EN,et al.hEST2,the putative human telomerase catalytic subunit gene,is up-regulated in tumor cells and during immortalization[J].Cell,1997,90(4):785-795.

[7]Xiang H,Wang J,Mao YW,et al.hTERT can function with rabbit telomerase RNA:regulation of gene expression and attenuation of apoptosis[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,278(3):503-510.

[8]陳始明，陶澤璋，肖伯奎,等.反義端粒酶催化亞單位抑制喉癌細(xì)胞生長(zhǎng)的離體實(shí)驗(yàn)研究[J].臨床耳鼻喉科雜志，2003，17(4)：226-228.

[9]Kim JG,Nonneman D,Vallet JL,et al.Linkage mapping of the porcine testis gene transcript(TEGT) gene to chromosome 5[J].Anim Genet,2003,34(2):152-153.

[10]Kawai-Yamada M,Saito Y,Jin L,et al.A novel Arabidopsis gene causes Bax-like lethality in Saccharomyces cerevisiae[J].J Bio Chem,2005,280(47):39468-39473.

[11]Westphalen BC,Wessig J,Levpoldt F,et al.BI-1 protects cells from oxygen glucose deprivation by reducing the calcium content of the endoplasmic reticulum[J].Cell Death Differ,2005,12(3):304-306.

[12]Ji J,Wernli M,Klimkait T,et al.Enhanced gene silencing by the application of multiple specific small interfering RNAs[J].FEBS Letters,2003,552(2/3):247-252.

[13]Li Y,Li M,Yao G,et al.Telomerase inhibition strategies by siRNAs against either hTR or hTERT in oral squamous cell carcinoma[J].Cancer Gene Ther,2011,18(5):318-325.

[14]Liang Y,Li XY,Lin RW,et al.Combinatorial gene targeting hTERT and Bi-1 in CNE-2 nasopharyngeal carcinoma cell line[J].Biomed Rep,2013,1(2):285-293.

The effect of RNA interference induced by inhibition of hTERT and Bi-1 gene expression*

WangHuimin1,HeKexin2,XuJianhua1,ShangChenyu1,ZhouKeyuan3△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedical,Guangzhou,Guangdong510120，China；2.DepartmentofClinicalLaboratory,BrainHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510370，China；3.InstituteofBiochemistryandMolecularBiology,GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang,Guangdong524023，China)

Objective In this study,we constructed a series of recombinant plasmids carriers expressing shRNA targeting hTERT and Bi-1 gene.These recombinant plasmids carriers were transfected into CNE-2Z cell lines using Lip and continuously induced the expression of shRNAs.Furthermore,the shRNAs caused the degradation of mRNAs homologous in sequence with the target genes,which lead to a sequence-specific gene silencing.Methods The CNE-2Z cells was divided into untreated group,pEGFP-N1 group and pEGFP-N1/Lip group.Flow cytometry(FCM) was applied to determine the transfection efficiency.The changes of hTERT and Bi-1 gene expression were detected by Real-time RT-PCR and Western blotting.Results The best transfection efficiency between plasmid and Lip was 2.5 μg plasmid and 6.25 μL Lip.Conclusion We constructed several shRNA recombinant eukaryotic expression plasmids successfully.The recombinant plasmid can inhibit the expression of hTERT and Bi-1 gene specifically and effectively.

hTERT；bax inhibitor-1；RNAi

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.08.002

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目基金資助項(xiàng)目(2011B031800207)。 作者簡(jiǎn)介：王會(huì)敏(1981-)，主管技師,碩士,主要從事臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)的研究?！?/p>

，Tel：13422041245；E-mail：kyz@gdmc.edu.cn。

R739

A

1671-8348(2015)08-1012-05

2014-10-10

2014-12-18)