周發(fā)為

445000湖北民族學院附屬民大醫(yī)院檢驗科

銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥機制分析

周發(fā)為

445000湖北民族學院附屬民大醫(yī)院檢驗科

目的：了解銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥機制。方法：選取臨床分離的銅綠假單胞菌89株，采用紙片擴散法行藥敏試驗、紫外線吸收法行膜微孔蛋白oprD2基因測定、紙片協(xié)同試驗測定金屬β-內(nèi)酰胺酶，同時采用Etest試驗了解氰氯苯腙對亞胺培南最低抑菌濃度的影響。對所有試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。結(jié)果：耐藥銅綠假單胞菌菌株oprD2含量明顯低于敏感銅綠假單胞菌菌株(P＜0.05)；且有耐藥銅綠假單胞菌菌株產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶；同時還有耐藥銅綠假單胞菌菌株存在主動外排泵出機制。結(jié)論：oprD2含量降低、β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生、主動外排泵出機制是導致銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的主要作用機制。

銅綠假單胞菌；亞胺培南；耐藥機制

銅綠假單胞菌是導致醫(yī)院內(nèi)獲得性感染的常見菌種之一，近年來耐藥率不斷地在增加，尤其是對亞胺培南的耐藥[1-2]，給患者的救治造成嚴重影響。本研究對臨床分離的89株銅綠假單胞菌菌株進行有關(guān)分析，旨在探討銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥機制。

資料與方法

菌株來源：2013年1月-2014年3月住院患者的痰、尿液等標本89株，分離得菌株。所有入選菌株均經(jīng)全自動微生物分析儀和GNI+鑒定卡進行檢測，并確認。

方法：對89株菌株均進行藥敏試驗、膜微孔蛋白oprD2基因測定等檢測。具體操作方法：①藥敏試驗：采用紙片擴散法，按常規(guī)操作流程進行細菌的培養(yǎng)和鑒定。采用美國臨床實驗室標準化委員會頒布的標準對結(jié)果進行判讀。②膜微孔蛋白oprD2基因測定：采用外膜蛋白圖、紫外線吸收法進行測定。從M-H瓊脂平板上選取單個銅綠假單胞菌菌落置入20 mL LB肉湯中，充分震蕩后留置15～20 h。取1.5 mL培養(yǎng)液重新置入到30 mL LB肉湯中留置20 h。以7 500 r/min，溫度4℃離心10 min后，使用磷酸鹽緩沖液(pH值7.0)沖洗2次。后置冰浴超聲破菌，每50 s停15 s，連續(xù)5次。再次以5 000 r/min，溫度4℃離心10～15 min，取上清液。將沉淀顆粒懸浮于10 mmol/L磷酸鹽緩沖液，常溫中放置30 min后，以30 000 r/min，常溫離心30 min，去掉上清液后，使用1%的十二烷基肌氨酸鈉沖洗2次，提取外膜蛋白懸浮于10 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，經(jīng)紫外線吸收法測定oprD2含量。③β-金屬酶測定：采用紙片協(xié)同試驗進行檢測。具體操作方法：選用0.5麥氏單位的培養(yǎng)液均勻涂抹于M-H瓊脂平板上，中間貼10 g亞胺培南，并在距離紙片1.5～2.5 cm處另貼1張空白紙片，加入3μL[A1]2-羥基乙醇原液，35℃環(huán)境中過夜，若靠近2-羥基乙醇原液側(cè)的亞胺培南抑菌環(huán)有擴大，則提示β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生。④氰氯苯腙對亞胺培南最低抑菌濃度的影響；采用Etest試驗進行測定，具體操作：配制水解絡(luò)蛋白M-H瓊脂和含濃度5 mg/L的氰氯苯腙的M-H瓊脂平皿。選取2～3個過夜培養(yǎng)的菌落，注入0.9%氯化鈉注射液調(diào)節(jié)至0.5麥氏單位。依照K-B法涂布菌混懸液和貼Etest試劑，放入35℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h，了解氰氯苯腙對亞胺培南最低抑菌濃度的逆轉(zhuǎn)作用。當氰氯苯腙存在時，亞胺培南的最低抑菌濃度比缺乏時，相應(yīng)的最低抑菌濃度下降至25%時，提示存在主動外排泵出機制。

統(tǒng)計學處理：數(shù)據(jù)由SPSS 13.0數(shù)據(jù)分析軟件處理而得，計量資料用(±s)表示，差異性比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果：紙片試驗顯示89株菌株中有36株對亞胺培南耐藥，另53株則提示為敏感。

oprD2基因含量：耐藥的36株菌的oprD2基因含量明顯低于敏感的53株，見表1。

β-內(nèi)酰胺酶36例耐藥菌株中共檢出β-內(nèi)酰胺酶5株，檢出率13.88%。

主動外排泵出機制：36例耐藥菌株中氰氯苯腙存在使亞胺培南最低抑菌濃度下降的菌株共7株(19.44%)。

表1 耐藥菌株與敏感菌株oprD2基因含量(±s)

表1 耐藥菌株與敏感菌株oprD2基因含量(±s)

組別 oprD2基因含量 t P耐藥菌(n=36) 2.13±0.82 9.7409 ＜0.05敏感菌(n=53) 4.05±0.97

討論

銅綠假單胞菌是導致人體局部和全身性感染的常見原因，而亞胺培南是治療的首選[3]，但耐藥性有增加。本研究結(jié)果顯示oprD2含量降低、β-內(nèi)酰胺酶、主動外排泵出機制存在是銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥機制。外膜膜微孔蛋白oprD2是目前銅綠假單胞菌擴散的唯一特異性通道，其降低可導致藥物難以進入菌體，從而使作用減弱，逐漸形成耐藥；β-內(nèi)酰胺酶大部分由質(zhì)粒介導，極易在不同的菌株間進行傳播，其可導致銅綠假單胞菌的爆發(fā)流行；主動外排泵出機制有控制抗菌藥物進出細胞和轉(zhuǎn)運抗菌藥物的作用，而氰氯苯腙能導致轉(zhuǎn)運蛋白失去能量供應(yīng)而抑制亞胺培南最低抑菌濃度，降低其抑菌效果。

總之，oprD2含量降低、β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生、主動外排泵出機制是導致銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的主要作用機制。

[1]李杰,蘇維奇.耐亞胺培南銅綠假單胞菌的耐藥特征及其耐藥機制研究[J].中國實驗診斷學,2011,15(3):475-477.

[2]余廣超,徐霖,袁廣卿,等.亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌的金屬β-內(nèi)酰胺酶檢測[J].中國抗生素雜志,2011,36(3):223-227.

[3]李小靖,陳武嘉,鐘燕玲,等.對亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌藥敏情況分析[J].中國醫(yī)藥科學,2012,2(14):106-107.

表1 兩組治療前后精液質(zhì)量比較

表2 兩組治療前、治療后6個月性激素水平比較(±s)

表2 兩組治療前、治療后6個月性激素水平比較(±s)

注：★表示與同組治療前比較，P＜0.05；▲表示與對照組同時期比較，P＜0.05。

組別 時間 FSH(IU/L) LH(IU/L) T(mg/L)觀察組 治療前 13.35±3.75 18.27±1.75 3.13±0.91治療后6個月 8.99±1.93★ 5.50±1.89★ 7.21±1.78★▲對照組 治療前 14.13±1.38 17.82±3.59 2.29±0.75治療后6個月 9.48±1.23★ 8.44±1.28★ 4.57±1.26★

結(jié)果

兩組患者精子質(zhì)量比較：兩組患者治療后的精子質(zhì)量明顯優(yōu)于治療前，觀察組治療后的精子質(zhì)量改善效果明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

兩組性激素水平比較：兩組患者治療后的性激素水平明顯優(yōu)于治療前，觀察組治療后的性激素水平改善效果明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

討論

VC伴不育的機制是多種多樣的，從不同的角度有不同的解釋，現(xiàn)階段最新研究證實，氧化應(yīng)激反應(yīng)可能是其主要的機制之一。其在分子水平的研究還在進行當中，有可能會開辟VC伴不育診療的新途徑[2]。β胡蘿卜素是一種臨床常用的抗氧化劑，β胡蘿卜素通過干擾光敏氧化和作為還原劑保護脂質(zhì)并清除自由基。為了探索這方面的臨床療效，筆者觀察了克羅米芬聯(lián)合β胡蘿卜素對VC伴不育高位結(jié)扎術(shù)后患者精子質(zhì)量和性激素水平的影響，為開創(chuàng)新的治療途徑積累了一些臨床經(jīng)驗。結(jié)果顯示，兩組患者治療后的精子質(zhì)量明顯優(yōu)于治療前，觀察組治療后的精子質(zhì)量改善效果明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；兩組患者治療后的性激素水平明顯優(yōu)于治療前，觀察組治療后的性激素水平改善效果明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。此結(jié)果說明，克羅米芬聯(lián)合β胡蘿卜素對精索靜脈曲張伴不育高位結(jié)扎術(shù)后精子質(zhì)量和性激素水平均有所提高，大大增加了受孕幾率。

綜上所述，抗氧化劑確實可以聯(lián)合用藥，提高了VC伴不育的治療效果，在臨床上收到了很好的效果，為治療VC伴不育開創(chuàng)了新的途徑和治療思路。但此次研究結(jié)果只是臨床上很少有的數(shù)據(jù)，還需大量的此方面的研究進行支持，特別是闡明其作用的確切機理的基礎(chǔ)研究。

參考文獻

[1]張秋養(yǎng),邱曙東.與精索靜脈曲張相關(guān)不育的機理研究[J].現(xiàn)代泌尿外科雜志,2004,9 (3):184-186.

[2]孫成亮.小切口集束型腹膜后精索靜脈高位結(jié)扎術(shù)在精索靜脈曲張伴不育患者中的應(yīng)用[J].湖北民族學院學報(醫(yī)學版), 2012,(1):30-32.

Analysising of the mechanism of imipenem resistant pseudomonas aeruginosa

Zhou Fawei
Department of Inspection of Minda Hospital,Affiliated Hospital of Hubei Institute for Nationalities 445000

Objective:To understand the mechanism of imipenem resistant pseudomonas aeruginosa.Methods:89 strains of clinical isolates of pseudomonas aeruginosa were selected.Disk diffusion method was used for drug sensitivity test,ultraviolet absorption method for the determination of microporous membrane protein oprD2gene,disk synergy test determination ofβ-metal enzyme, while understanding the effect of cyanide chlorophenylhydrazone on imipenem minimum inhibitory concentration by using Etest test.Results:oprD2resistant pseudomonas aeruginosa strains were significantly lower than the sensitive strain of pseudomonas aeruginosa(P＜0.05),and drug resistant pseudomonas aeruginosa strains produceβ-metal enzyme;at the same time there are drug resistant pseudomonas aeruginosa strains existactive efflux pump mechanism.Conclusion:Decreased the content of oprD2, β-metal enzyme producing,active efflux pumpmechanism were the main mechanism resulting in pseudomonas aeruginosa resistantto imipenem.

Pseudomonas aeruginosa;Imipenem;Resistance mechanisms

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.6.2