陳靜怡等

摘 要：為了高效、充分、合理地利用畜骨資源，以新鮮羊骨為原料，骨粉得率為考察指標，通過單因素實驗和正交實驗分析來探究不同因素對羊骨粉得率的影響。實驗結果表明：冷凍溫度-80℃，脫脂時間4h，脫脂轉(zhuǎn)速400r/min，酶用量1.2g，酶解時間4h，酶解加水量200ml，酶解溫度45℃時，骨粉得率最高，可達83.34%。營養(yǎng)學分析結果顯示：鈣含量為12%-16%，磷含量為2%-4%，氨基酸含量24.58%-26.14%。

關鍵詞：羊骨；低溫冷凍；酶解；正交

我國是一個畜牧大國，畜禽總產(chǎn)量和消耗量一直在不斷增長，穩(wěn)居世界前列[1]。畜禽骨約占其體重的20%-30%左右[2]，是一種營養(yǎng)價值極高，廉價易得的肉類加工副產(chǎn)物。羊骨性味肝溫，具有補腎、強筋的作用，可用于減輕血小板減少性子癜，再生不良性貧血、筋骨疼痛等癥狀[3，4]。研究證實，羊骨具有極高的營養(yǎng)價值，其含有與肉類相似的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和易被人體吸收的最佳鈣、磷比例的鈣磷鹽[5，6]，并可作為血色素鐵良好的補充源[7]。羊骨中含有的膠原蛋白和軟骨素的成分占總蛋白質(zhì)含量的90%以上，此外還含有豐富的礦物質(zhì)、維生素、骨膠和軟骨素等[8]。羊骨中富含多種天然營養(yǎng)成分，是一種天然的表面活性劑，它不僅在食品行業(yè)逐漸成為一個獨特的新的食物源，在工業(yè)、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等產(chǎn)業(yè)上，同樣具有較高的科學價值和經(jīng)濟效益[9，10]。我國對于羊骨的開發(fā)利用起步較晚，開發(fā)方向也局限在羊骨多肽和螯合鈣上[11]。骨類原料在實際加工生產(chǎn)過程中，因其質(zhì)地組成不同、硬度不一，后期粉碎較難控制，所以骨的細度一直受到廣泛關注[12]。Field的研究表明，110μm以下的骨粒可以被人體胃液溶解，骨粉的生產(chǎn)關鍵是使骨的粒度達到110μm以下，因此本試驗選用200目骨粉得率作為考察指標[13]。目前國內(nèi)對骨粉的加工方法主要有以下幾種：高溫蒸煮法；低溫冷凍法；化學水解法；酶處理水解法等[14]。單一的加工方法很難合理有效利用羊骨資源，綜合考慮不同加工方法的優(yōu)缺點，文章采用低溫冷凍和酶解相結合的方法加工羊骨資源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

羊腿骨：購買于周谷堆批發(fā)市場。

中性蛋白酶（20萬μg/g）：上海佳和生物科技有限公司；

EDTA，NaOH，HCl，HNO3，HClO4，H2SO4），CaCO3，NaSO3，KH2PO4，鈣羧酸，鉬酸銨，對苯二酚，乙酸乙酯等化學試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗儀器

TP-3000電子天平：湘儀天平儀器設備有限公司；高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；超微粉碎機：北京環(huán)亞天元機械技術有限公司；超低溫冰箱：中科美菱有限公司；數(shù)據(jù)恒溫水浴鍋：江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；HJ-5多功能攪拌器：金壇市晶玻實驗儀器廠；GZX-9070 MBE數(shù)顯鼓風干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；標準篩（100目，200目）：浙江上虞市水仙儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器：金壇市杰瑞而電器有限公司；氨基酸自動分析儀L-8900：日立公司；紫外可見分光光度計：752型，上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程（見圖1）

1.3.2 實驗方案

準確稱取50.00g冷凍后粗粉碎的碎骨于兩個錐形瓶中，按照“1.3.1”的工藝流程加工處理羊腿骨。考察脫脂與酶解的先后順序、冷凍溫度、脫脂時間、脫脂轉(zhuǎn)速、酶用量、酶解時間、酶解骨水比、酶解溫度對羊骨粉得率的影響。實驗過程中，采用控制變量法進行實驗，一般控制條件為：先脫脂后酶解、冷凍溫度-25℃，，脫脂時間5h，脫脂轉(zhuǎn)速300r/min，中性蛋白酶酶量1g，酶解溫度50℃，酶解時間4h，酶解加水量200ml。對單因素最佳實驗條件下的骨粉進行營養(yǎng)學分析。根據(jù)單因素實驗結果，選擇酶解時間，酶解溫度和脫脂時間三個因素采用L（3）正交實驗進行正交優(yōu)化，因素水平見表1。

表1 因素水平表

1.3.3 計算與分析方法

200目骨粉得率=■×100%

M：骨粉的總質(zhì)量；M1：100目以上的骨粉質(zhì)量；M2：200目以上骨粉的質(zhì)量。

鈣含量測定：高猛酸鉀法[15]。

磷含量測定：分光光度法[15]。

氨基酸測定：氨基酸自動分析儀法[15]。

2 試驗結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 脫脂與酶解先后順序?qū)欠鄣寐实挠绊?/p>

脫脂和酶解的先后順序?qū)欠鄣寐实挠绊懸妶D2。

由圖2可知，先脫脂后酶解的骨粉得率遠遠高于先酶解后脫脂，原因可能是因為鮮羊骨先脫脂后，脂肪去除，酶解過程中，酶能和底物充分接觸，能有效的水解鮮骨表面的一些肌肉蛋白組織，使其分解成更小的多肽鏈或氨基酸，從而達到更好的分離效果。

2.1.2 冷凍溫度對骨粉得率的影響

冷凍溫度對骨粉得率的影響見圖3。

由圖3可知，冷凍-80℃的羊骨粉得率為64.78%，明顯高于冷凍-25℃的羊骨粉得率。鮮骨在超低溫情況下，骨細胞內(nèi)外都會形成冰晶，造成細胞脫水、皺縮，使細胞膜類脂蛋白復合物變性，加大了對骨細胞的破壞；同時溫度越低，玻璃化轉(zhuǎn)變形態(tài)更迅速、徹底，內(nèi)部組織結合力越弱，在相同的外部作用力下，粉碎效果更好。

2.1.3 脫脂時間對骨粉得率的影響

脫脂時間對骨粉得率的影響如圖4所示。

由圖4可知，隨著脫脂時間的增加，羊骨粉得率呈上升趨勢，在脫脂時間為5h時，達到最大得率，而后開始下降。分析原因，開始時隨著脫脂時間的增加，在乙酸乙酯的作用下，粗骨粉中的脂肪得到進一步的去除，超微粉碎后過篩更加容易，減少了骨粉的損失，增加了得率。隨著脫脂時間的繼續(xù)增加，骨中蛋白質(zhì)等其它營養(yǎng)成分開始流失，骨粉得率下降。

2.1.4 脫脂轉(zhuǎn)速對骨粉得率的影響

脫脂轉(zhuǎn)速對骨粉得率的影響如圖5所示。

由圖5可知，隨著脫脂轉(zhuǎn)速的增加，羊骨粉的得率不斷增加，達到400r/min時達到最大，而后基本不變。分析原因，隨著轉(zhuǎn)速的增加，顆粒之間摩擦程度加大，更有利于脫脂的進行。因此，脫脂轉(zhuǎn)速控制在400r/min。

2.1.5 酶用量對骨粉得率的影響

酶用量對骨粉得率的影響如圖6所示。

由圖6可知，酶用量在1.2g時，骨粉得率最高，在兩邊區(qū)域，提取率均有所降低。分析其原因，中性蛋白酶是一種生物催化劑，和底物的反應有一定的飽和度。隨著酶用量的增加，酶與底物的結合是逐漸飽和的，因此提取率不斷提高；然而，當酶用量達到最大飽和值后，羊骨中蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分開始流失，骨粉得率下降。

2.1.6 酶解時間對骨粉得率的影響

酶解時間對骨粉得率的影響如圖7所示。

由圖7可知，酶解時間為4h時骨粉得率最大。酶解時間繼續(xù)延長時，骨粉得率反而略有下降。原因是開始隨著酶解時間的增加，中性蛋白酶作用不斷增強，到達一定時間酶促反應已經(jīng)基本完成，同時還保留有較多的羊骨中的有效成分，但隨著時間的進一步增加，羊骨中的有效成分也被會逐漸被酶降解而使得率下降。

2.1.7 酶解加水量對骨粉得率的影響

酶解加水量對骨粉得率的影響如圖8所示。

由圖8可知，開始隨著酶解加水量的增加，羊骨得率逐漸增加，加水量達到200ml時達到最大得率。分析原因，隨著加水量的增加，粗骨粉與酶接觸的比表面積增加，能達到更好的酶解效果，隨著加水量的繼續(xù)增加，可能會導致中性蛋白酶對粗骨粉的附著力降低，酶解效果不佳，使得得率略有下降。因此，單因素實驗中確定的最佳酶解加水量為200ml。

2.1.8 酶解溫度對骨粉得率的影響

酶解溫度對骨粉得率的影響如圖9所示。

由圖9可以看出，隨著溫度的增加，酶促反應加快，骨粉得率不斷提高；45℃時，得率最高，而后隨著溫度的繼續(xù)升高而下降。酶是一種生物催化劑，其反應有最適反應溫度，溫度過低或過高，都會導致酶促反應速率下降或者酶失活，進而影響骨粉得率。

2.2 正交試驗結果

由表2可知：根據(jù)極差分析確定因素對實驗指標影響的主次順序是B>C>A，即酶解溫度對骨粉200目得率影響最大，其次是脫脂時間，而酶解時間對羊骨粉得率的影響最小。根據(jù)因素水平k值確定優(yōu)組合為A2B2C2，即理想的超微羊骨粉制備最優(yōu)工藝為酶解時間4h，酶解溫度45℃，脫脂時間4h，進行驗證實驗，結果表明羊骨粉得率可以達到83.34%。

2.3 骨粉營養(yǎng)學分析

氨基酸自動分析儀分析測得牛骨粉中氨基酸含量為24.58%-26.14%，其中必須氨基酸3.58%-3.86%。分光光度法測定磷含量2-4%，高猛酸鉀法測得鈣含量12%-16%，各項指標均較好。

3 結論與分析

文章以新鮮羊骨為原料，以200目骨粉得率為考察指標，采用低溫冷凍和酶解相結合的方法處理加工羊骨，考察不同因素對羊骨粉得率的影響。實驗結果表明：先脫脂后酶解，冷凍溫度-80℃，脫脂時間4h，脫脂轉(zhuǎn)速400r/min，酶用量1.2g，酶解時間4h，酶解加水量200ml，酶解溫度45℃時，骨粉得率最高，可達83.34%。營養(yǎng)學分析結果顯示：鈣含量為12%-16%，磷含量為2%-4%，氨基酸含量24.58%-26.14%。

參考文獻

[1]何志謙.人類營養(yǎng)學[M].北京人民衛(wèi)生出版社，1988.

[2]王衛(wèi)，張志宇，劉達玉，等.畜禽骨加工利用及其產(chǎn)品開發(fā)[J].食品科技，2009，34（5）：154-158.

[3]馮雅榮，馬儷珍.羊骨降血壓肽制備工藝的研究[J].山西農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2011，31（3）：253-256.

[4]劉玉花，馬儷珍，孔保華，等.羊骨膠原螯合鈣肽酶解工藝的研究[J].肉類研究，2008（4）：25-29.

[5]蔣箐莉，任發(fā)政.食源性降血壓肽的評價方法[J].中國乳品工業(yè)，2006（6）：36-40.

[6]楊迎伍，張利，李正國.畜骨的營養(yǎng)價值、開發(fā)利用現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J].食品科技，2001（1）：60-62.

[7]OLIVEIRAMN，MAKTS，GGEBERHD.Manufcture of fermented lactic beverages containing probiotic cultures[J].Journal of Food science，2002，67（6）：2336-2341.

[8]趙玉紅.骨的綜合利用[J].肉類工業(yè)，2011（3）.

[9]韓濤，亢文華，原霖，等.動物無害化處理與資源利用進展[J].中國動物檢疫，2015，2：47-49

[10]黃紅衛(wèi)，邱燕翔.超細粉碎酶解鮮骨粉功能性調(diào)味料的研究[J].肉類研究，2002（2）：35-36+44.

[11]黃 秋，陳家文.肉骨粉類飼料在畜牧業(yè)上的應用與研究[J].四川畜牧獸醫(yī)，2011（9）：32-34.

[12]馬峰，周倩，李夢潔，等.普通骨粉和超細骨粉改善骨密度功能比較[J].食品研究與開發(fā)，2014，35（2）：17-21.

[13]曹雁平.我國畜骨綜合加工利用現(xiàn)狀[J].糧油加工與食品機械，2001（9）：6-8.

[14]高巖，張志潔，等.超微粉碎畜骨粉[J].肉類加工，2001，7（205）：18-20.

[15]翟永信.現(xiàn)代食品分析手冊[M].北京：北京大學出版社，1988：176-239+277+342-356.

作者簡介：陳靜怡（1991-），女，漢族，安徽潁上人，碩士生，主要從事生物化學、食品生化研究。

*通訊作者：肖厚榮