吳巍蕓

【摘要】 目的：探討miR-195對(duì)大腸癌細(xì)胞HT-29增殖和凋亡的影響及可能的機(jī)制。方法：應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將miR-195 mimics轉(zhuǎn)染入HT-29細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-195的表達(dá)，分別采用CCK-8法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡情況，qRT-PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后VEGFA mRNA和蛋白表達(dá)變化。結(jié)果：與NC組比較，miR-195 mimics轉(zhuǎn)染組明顯上調(diào)HT-29細(xì)胞miR-195的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，下調(diào)VEGFA mRNA及蛋白表達(dá)，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：上調(diào)HT-29細(xì)胞的miR-195表達(dá)，可明顯抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制其靶基因VEGFA表達(dá)相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 微小RNA； 大腸癌； 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A； 增殖； 凋亡

【Abstract】 Objective： To investigate the effect of miR-195 on proliferation and apoptosis of colorectal cancer cell line HT-29 and its mechanism.Method： MiR-195 mimics was transfected into HT-29 cells by lipofectamine 2000. The miR-195 expression was measured by real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction （qRT-PCR），cell proliferation and apoptosis were respectively evaluated by CCK-8 assay and flow cytometry.VEGFA mRNA and protein were assessed by qRT-PCR and Western blot. Result：miR-195 mimics group was significantly increased miR-195 expression in HT-29 cells， inhibited cells proliferation and increased cells apoptosis and downregulation of mRNA VEGFA and protein expression， compared with the NC group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Overexpression of miR-195 in HT-29 cells may significantly suppress cells proliferation and induce cells apoptosis， probably via downregulating its target gene VEGFA expression.

【Key words】 MicroRNA； Colorectal cancer； VEGFA； Proliferation； Apoptosis

First-authors address：Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Zhanjiang 524001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.35.008

大腸癌（Colorectal cancer，CRC）是消化道常見的惡性腫瘤，發(fā)病率逐漸增高，并呈現(xiàn)出年輕化的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類健康。癌基因和抑癌基因及信號(hào)通路的調(diào)控、表達(dá)失常，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。近年來，越來越多的研究者開始關(guān)注微小RNA（microRNA，miR）在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。miRNAs是一類具有調(diào)控功能的非編碼小分子RNA，通過與靶基因mRNA的特定位點(diǎn)部分和完全結(jié)合，導(dǎo)致mRNA的降解和/或阻礙其翻譯[1]。研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤存在異常的miRNAs表達(dá)譜[2-4]。其中，與正常大腸組織相比，miR-195在CRC組織中表達(dá)降低，但miR-195在CRC中的作用及其機(jī)制尚未完全明確[5-6]。本實(shí)驗(yàn)通過上調(diào)HT-29細(xì)胞的miR-195表達(dá)，初步探討miR-195在CRC中的作用及機(jī)制，現(xiàn)將其具體報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 HT-29細(xì)胞株（中科院上海細(xì)胞庫）于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。人miR-195 模擬物（miR-195 mimics）、miR-195 mimics陰性對(duì)照（miR-195 mimics NC）購于廣州銳博生物公司。轉(zhuǎn)染前將HT-29細(xì)胞接種至6孔或12孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按miRNA mimics轉(zhuǎn)染操作說明書混合Opti-MEM I培養(yǎng)基、miR-195 mimics或NC和lipofectamine 2000，將混合物加入鋪好的6孔板中，放入37 ℃，5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，換為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至所需時(shí)間，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)各項(xiàng)相關(guān)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)分為兩組，miR-195 mimics轉(zhuǎn)染組：轉(zhuǎn)染miR-195 mimics（終濃度100 nmol/L）；NC組：轉(zhuǎn)染miR-195 mimics NC（終濃度100 nmol/L）。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）檢測(cè)miR-195和VEGFA mRNA的表達(dá) 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，用TRIzol提取總RNA。按RT-PCR試劑盒（Takara）說明書進(jìn)行miR-195和VEGFA的逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)。分別以U6 snRNA和β-actin作為內(nèi)參。應(yīng)用羅氏LightCycler 480型PCR儀進(jìn)行定量PCR分析。miR-195上游引物：5-TAGCAGCACAGAAATATTGGC-3；U6上游引物：5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3；VEGFA上游引物：5-GAGCAGCGAAAGCGACAG-3，VEGFA下游引物：5-CTCCGAAGCGAGAACAGC-3；β-actin上游引物：5-GGCGGCAACACCATGTACCCT-3，β-actin下游引物：5-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3。反應(yīng)結(jié)束后得到各樣本miR-195和U6的循環(huán)數(shù)（Ct值），根據(jù)2-△Ct法計(jì)算miR-195的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 HT-29細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)液體積200 μL，按上述分組轉(zhuǎn)染，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 μL CCK-8（Dojindo公司），37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h后于酶標(biāo)儀上450 nm測(cè)定各孔吸光度（A450）。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)時(shí)間和吸光度值繪制增殖曲線。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 HT-29細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板，分別轉(zhuǎn)染miR-195 mimics和NC，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌后依次分別加入Annexin V-FITC（碧云天公司）室溫避光孵育10 min和碘化丙啶（PI）（碧云天公司）冰浴避光孵育30 min，上機(jī)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western blot檢測(cè)VEGFA蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染72 h后，用Western及IP細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度后，每個(gè)泳道上樣40 μg蛋白樣品，SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%牛奶封閉非特異位點(diǎn)，抗VEGFA抗體（Santa Cruz，1∶500）4 ℃孵育過夜。相應(yīng)的二抗（1∶1000）室溫孵育1 h，暗室顯影，以Tubulin作為內(nèi)參，以VEGFA蛋白與Tubulin蛋白條帶的光密度比值計(jì)算VEGFA蛋白的相對(duì)含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞miR-195表達(dá)比較 miR-195 mimics轉(zhuǎn)染組的miR-195表達(dá)水平明顯高于NC組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

2.2 兩組細(xì)胞增殖情況比較 CCK-8檢測(cè)兩組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖情況，miR-195 mimics轉(zhuǎn)染組于48、72 h增殖率較相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的NC組明顯下降，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

2.3 兩組細(xì)胞凋亡情況比較 轉(zhuǎn)染miR-195 mimics至HT-29細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，miR-195 mimics轉(zhuǎn)染組凋亡細(xì)胞較NC組明顯增加，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖3～4。

2.4 兩組細(xì)胞的VEGFA表達(dá) qRT-PCR和Western blot檢測(cè)顯示，miR-195 mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞VEGFA mRNA和蛋白的表達(dá)水平均較NC組明顯降低，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖5。

3 討論

目前已有研究證實(shí)miRNAs在大腸癌的診斷、預(yù)后判斷及治療效果預(yù)測(cè)中均發(fā)揮作用[7-9]。另外，miRNAs在癌前病變發(fā)展，對(duì)大腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，新生血管生成中的作用等基礎(chǔ)領(lǐng)域研究亦不斷有新的進(jìn)展[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-195在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Guo等[13]報(bào)道與正常組織比較，miR-195在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞株的表達(dá)明顯下調(diào)，過表達(dá)miR-195能抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力。miR-195通過作用于其靶基因脂肪酸合酶（FASN），抑制骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[14]。Yang等[15]亦報(bào)道，miR-195在乳腺癌細(xì)胞株和多藥耐藥的乳腺癌組織中均表達(dá)下降，上調(diào)miR-195的表達(dá)可以抑制乳腺癌細(xì)胞的活力，促進(jìn)其凋亡，增加其對(duì)阿霉素治療的敏感性。miR-195在腎上腺皮質(zhì)癌患者的癌組織和血清中表達(dá)水平均降低，其血清低表達(dá)與較短的無復(fù)發(fā)生存和較短的總體生存有關(guān)，對(duì)于腎上腺皮質(zhì)癌患者的預(yù)后預(yù)測(cè)有一定的價(jià)值[16]。多個(gè)研究顯示，與正常組織比較，miR-195在CRC組織表達(dá)降低[5-6]。在本研究中，筆者轉(zhuǎn)染miR-195 mimics使大腸癌細(xì)胞HT-29過表達(dá)miR-195，顯示細(xì)胞增殖減少、凋亡增多，提示miR-195在CRC中發(fā)揮促凋亡的作用，與前面研究一致。

VEGFA是腫瘤血管生成的主要刺激因子之一，通過與其受體VEGFR-2作用，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移。VEGFA在CRC組織中表達(dá)上調(diào)，高表達(dá)的VEGFA與腫瘤進(jìn)展及侵襲相關(guān)，是生存的一個(gè)重要預(yù)測(cè)因素[17]。使用VEGFA shRNA抑制RKO大腸癌細(xì)胞的VEGFA表達(dá)后，可使細(xì)胞周期停滯，減弱細(xì)胞增殖和侵襲能力，裸鼠種植瘤生長(zhǎng)延緩[18]。Tai等[19]用siRNA抑制大腸癌Volo細(xì)胞的VEGFA表達(dá)后，亦可以抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)凋亡。于多種大腸癌細(xì)胞株，如SW620、HCT-116上使用RNAi技術(shù)干擾VEGFA表達(dá)也可得到類似的結(jié)果[20-21]。上述研究表明，VEGFA與大腸癌細(xì)胞的生物學(xué)特性相關(guān)。筆者通過電子信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)VEGFA是miR-195潛在靶基因之一。轉(zhuǎn)染miR-195 mimics后，與陰性對(duì)照組相比，VEGFA mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯下調(diào)，說明在CRC中miR-195可能通過抑制VEGFA的表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖和凋亡，可能是其參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。

綜上所述，miR-195在CRC中發(fā)揮著類似抑癌基因的作用，隨著研究的不斷深入，闡明miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制，以miRNA作為診斷和治療的靶點(diǎn)，具有巨大的潛在價(jià)值。

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（收稿日期：2015-08-20） （本文編輯：周亞杰）