徐塏 薛曉鷗 李健 馬秀麗 秦蕾

摘要：目的 探討紫柏凝膠藥物血清作用于高危型人乳頭瘤病毒感染相關性宮頸癌SiHa細胞的免疫學反應機制。方法 采用細胞培養(yǎng)及免疫組化方法，用不同濃度紫柏凝膠藥物血清作用宮頸癌SiHa細胞24、48、72 h后，分別標記出相同作用時間段不同濃度下及不同時間段相同濃度下白細胞介素（IL）-6、IL-10、CD83、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達的光密度，通過計算平均光密度，分析藥物作用與免疫因子IL-6、IL-10、CD83、TNF-α表達的量效與時效關系。結果 隨著藥物血清濃度及作用時間的增加，IL-6及TNF-α的免疫表達均逐漸減弱，CD83及IL-10的免疫表達均逐漸增強（P<0.05）。結論 紫柏凝膠藥物血清能夠通過改善宮頸局部免疫功能，抑制局部炎癥反應，從而抑制宮頸高危型人乳頭瘤病毒。

關鍵詞：高危型人乳頭瘤病毒；藥物血清；紫柏凝膠；免疫功能

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.017

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）07-0060-03

Effect of Zibai Gelatin for Cervical Cancer SiHa Cells XU Kai1， XUE Xiao-ou2， LI Jian3， MA Xiu-li2， QIN Lei2 （1.Zhejiang Provincial Hospital of TCM， Hangzhou 310006， China；2.Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China；3.Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

Abstract：Objective To investigate the immunological reaction mechanism of medicated serum in Zibai Gelatin for SiHa cells of the cervical cancer infected by high risk human papilloma virus （HPV）. Methods Through immunohistochemical comparison and the cell culture， and after medicated serum was administrated to SiHa cells of cervical cancer for 24 h， 48 h， and 72 h， optical densities of IL-6， IL-10， CD83 and TNF-α in the same time but different concentrations and different times but the same concentration were observed. Relationships of dose-effect and time-effect between expressions of IL-6， IL-10， CD83 and TNF-α and medicine action were analyzed by calculating average optical density. Results With the increase of medicine concentration and administration time of Zibai Gelatin， the expressions of IL-6 and TNF-α gradually decreased， while the expressions of CD83 and IL-10 gradually increased （P<0.05）. Conclusion Zibai Gelatin with medicated serum can inhibit local inflammatory reaction by improving local immunologic function of cervix， which is beneficial to reduce cervix high-risk HPV.

Key words：HPV；medicated serum；Zibai Gelatin；immunologic function

目前認為，宮頸高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）感染是宮頸癌發(fā)病的主要因素之一。宮頸局部的免疫功能變化在宮頸感染HR-HPV后與病變的發(fā)展存在著聯(lián)系，宮頸局部的免疫功能紊亂可能在宮頸疾病進展的過程發(fā)揮著某種作用[1]。紫柏凝膠外治宮頸HR-HPV感染，臨床療效肯定[2]，但中藥抑制降低宮頸HR-HPV

基金項目：北京市科技計劃“十病十藥”中藥專項（2015年）；北京市教育委員會共建項目建設計劃（2011年）

通訊作者：薛曉鷗，E-mail：xxo123@sina.com

復制增殖的作用機制目前尚不明確。有研究顯示，藥物發(fā)揮抗HR-HPV的作用實質是改善宮頸局部免疫環(huán)境[3]。本研究通過觀察紫柏凝膠對宮頸癌SiHa細胞的影響，探討其抑制宮頸HR-HPV的免疫作用機理。

1 實驗材料

1.1 動物

2只成年雌性中華白兔，體質量約2.5 kg，購于北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限責任公司，許可證號SCXK（京）2010-0001。飼養(yǎng)于北大醫(yī)學部普通動物實驗室。

1.2 藥物及藥物血清制備

將紫柏凝膠組方按原藥材比例（紫草20 g，黃柏20 g，百部20 g，兒茶20 g）配成平均為150 g/劑的顆粒劑，以1 g/kg給藥量換算進行兔喂養(yǎng)，每日3次，連續(xù)3個月后，末次給藥前8 h禁食不禁水，末次給藥后1 h，水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，37 ℃水浴靜置30 min，3000 r/min離心10 min，無菌分離血清，血清置于60 ℃恒溫水浴30 min處理，進行補體滅活，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝于1 mL無菌EP管中，置于-80 ℃冰箱中凍存，共取出紫柏凝膠藥物血清（DS）50 mL，備用。

1.3 細胞株

人子宮頸鱗癌SiHa細胞株（HPV16型感染），購自中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院細胞中心，傳代培養(yǎng)（Cell Resource Center IBMS.CAMS/PUMC）。

1.4 主要試劑與儀器

最低限度基礎（MEM）培養(yǎng)基，GIBCO；胎牛血清（FBS），Hyclone；胰酶-EDTA，MACGENE；DMSO，AMIRSCO；Rabbit Anti-白細胞介素（IL）-6、Rabbit Anti-IL-10、Rabbit Anti-CD83、Rabbit Anti-腫瘤壞死因子-α（TNF-α），Bioss；通用二抗山羊抗兔單克隆抗體，CWBIO；抗體稀釋液，INVITROGEN；DAB顯色試劑盒，CWBIO。程序凍存盒（北京澤平科技有限責任公司），DPH-360型電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京光明醫(yī)療儀器廠），海爾BD-2195冷柜（海爾集團），OLYMPUS光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司），尼康BR-3.2圖像分析系統(tǒng)（日本Nikon公司），HC-2514高速離心機（ZONKIA）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

宮頸癌SiHa細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的MEM（EBSS）培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長情況3～4 d傳代1次，按1∶3～6的比例傳代分瓶。

2.2 藥物作用

將處于對數(shù)生長期的宮頸癌SiHa細胞接種于48孔板中，每孔密度為2.0×105個/300 μL，培養(yǎng)液為含90%MEM培養(yǎng)基、含10%不同配比量的FBS及DS（4∶0、3∶1、2∶2、1∶3、0∶4）。設平行重復對照3組，實驗重復3次。

2.3 細胞免疫組化方法

終止細胞培養(yǎng)后，行PBS沖洗；4%多聚甲醛固定15 min，500 μL/孔；空氣干燥5 min；沖洗；0.5%TritonX-100（PBS稀釋）孵育20 min，300 μL/孔；沖洗；3%H202孵育15 min，300 μL/孔；沖洗；一抗（1∶150）孵育，37 ℃，1～2 h，100 μL/孔；沖洗；二抗（1∶200）孵育，37 ℃，0.5～1 h，100 μL/孔；沖洗；DAB顯色3～5 min，100 μL/孔；沖洗；蘇木素（1∶5稀釋）復染2 min，100 μL/孔；沖洗；照相。

2.4 觀察指標

不同濃度DS作用宮頸癌SiHa細胞24、48、72 h，分別標記相同時間段不同濃度及不同時間段相同濃度IL-6、IL-10、CD83、TNF-α表達的光密度。分析DS作用宮頸癌SiHa細胞與4個因子表達的量效關系及時效關系。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，采用IPP軟件進行各時點平均光密度分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，計量資料采用t檢驗，單向有序的計數(shù)資料采用卡方檢驗。檢驗水準α=0.05。

4 結果

4.1 藥物血清作用宮頸癌SiHa細胞與相關免疫因子表達的量效關系

不同濃度DS作用宮頸癌SiHa細胞24、48、72 h后，隨著藥物濃度的增加，IL-6及TNF-α表達逐漸下降，而CD83及IL-10表達逐漸升高；IL-6、TNF-α表達與藥物濃度呈負相關，而CD83、IL-10表達與藥物濃度呈正相關；IL-6、TNF-α、CD83及IL-10在各濃度間表達均存在差異（P<0.05）。結果見表1～表3。

表1 作用24 h各組宮頸癌SiHa細胞與免疫因子表達的量效關系

（—x±s，平均光密度值）

組別 IL-6 IL-10 TNF-α CD83

10%FBS 0.38±0.07 0.35±0.03 0.35±0.04 0.26±0.03

2.5%DS+7.5%FBS 0.32±0.06 0.37±0.04 0.32±0.03 0.28±0.02

5%DS+5%FBS 0.28±0.04 0.38±0.05 0.30±0.02 0.31±0.01

7.5%DS+2.5%FBS 0.27±0.04 0.39±0.05 0.28±0.01 0.34±0.01

10%DS 0.25±0.01 0.41±0.06 0.23±0.01 0.37±0.01

t絕對值 13.031 38.000 14.690 15.718

P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 作用48 h各組宮頸癌SiHa細胞與免疫因子表達的量效關系

（—x±s，平均光密度值）

組別 IL-6 IL-10 TNF-α CD83

10%FBS 0.39±0.05 0.34±0.04 0.34±0.03 0.26±0.02

2.5%DS+7.5%FBS 0.29±0.04 0.37±0.02 0.30±0.02 0.29±0.02

5%DS+5%FBS 0.25±0.03 0.40±0.03 0.27±0.01 0.33±0.01

7.5%DS+2.5%FBS 0.22±0.04 0.43±0.04 0.25±0.02 0.36±0.02

10%DS 0.16±0.02 0.46±0.03 0.19±0.03 0.42±0.03

t絕對值 6.824 18.856 10.757 11.933

P值 0.002 0.000 0.000 0.000

表3 作用72 h各組宮頸癌SiHa細胞與免疫因子表達的量效關系

（—x±s，平均光密度值）

組別 IL-6 IL-10 TNF-α CD83

10%FBS 0.38±0.06 0.35±0.04 0.33±0.02 0.25±0.02

2.5%DS+7.5%FBS 0.30±0.06 0.39±0.03 0.29±0.02 0.30±0.01

5%DS+5%FBS 0.23±0.03 0.43±0.04 0.23±0.04 0.39±0.03

7.5%DS+2.5%FBS 0.17±0.04 0.48±0.05 0.19±0.01 0.45±0.02

10%DS 0.10±0.03 0.52±0.04 0.12±0.02 0.53±0.04

t絕對值 4.831 14.262 6.282 7.625

P值 0.008 0.000 0.003 0.002

4.2 藥物血清作用于宮頸癌SiHa細胞與相關免疫因子表達的時效關系

相同濃度DS分別作用于宮頸癌SiHa細胞24、48、72 h后，隨著藥物作用時間的增加，IL-6、TNF-α表達逐漸下降，CD83、IL-10表達逐漸升高；IL-6、TNF-α表達與藥物作用時間呈負相關，而CD83、IL-10表達與藥物作用時間呈正相關；IL-6、TNF-α、CD83及IL-10不同作用時間的表達差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果見表4。

表4 10%DS作用宮頸癌SiHa細胞與免疫因子表達的時效關系

（—x±s，平均光密度值）

時間 IL-6 IL-10 TNF-α CD83

24 h 0.25±0.01 0.41±0.06 0.23±0.01 0.37±0.01

48 h 0.16±0.02 0.46±0.03 0.19±0.03 0.42±0.03

72 h 0.10±0.03 0.52±0.04 0.12±0.02 0.53±0.04

t絕對值 5.900 14.571 5.600 9.311

P值 0.024 0.005 0.030 0.011

5 討論

本實驗結果表明，紫柏凝膠作用宮頸癌SiHa細胞，能有效改善宮頸局部的免疫功能，使局部炎癥反應降低。實驗所選免疫因子具有特異性強的特點，故作為藥物血清作用后觀察的靶向目標。其中CD83分子是凋亡小體，研究發(fā)現(xiàn)，CD83與宮頸的腫瘤細胞浸潤分化密切相關[4]，當正常凋亡減少，炎癥介質增多，隨之而來的則是宮頸病變進展，CD83因子受到抑制，而當藥物發(fā)揮作用時，對宮頸微環(huán)境進行修復，則正常的凋亡使得CD83因子高表達。IL-6在免疫調節(jié)中同樣發(fā)揮著重要作用，藥物使免疫功能得到恢復，表現(xiàn)為促炎因子IL-6的表達明顯下降。對宮頸HR-HPV感染進行有效的藥物干預，會使IL-10表達上升，IL-10不但能影響免疫系統(tǒng)，還能通過調節(jié)相關的細胞因子來影響機體內(nèi)的生理病理過程。TNF-α在宮頸病變及宮頸惡性腫瘤疾病中都是重要的介導細胞因子，其主要具有促炎的作用，從而促進炎癥及腫瘤生長，故與宮頸腫瘤疾病相關。在使用藥物干預情況下，TNF-α的表達會發(fā)生明顯變化。宮頸HR-HPV感染后，局部免疫功能平衡被破壞[5]，宮頸HR-HPV持續(xù)性感染的患者，主要存在宮頸局部免疫功能低下及HR-HPV病毒免疫逃逸作用。Clarke等[6]發(fā)現(xiàn)，HR-HPV感染機體后，會阻斷細胞信號的傳遞，引起局部的炎癥反應。宮頸局部由于受到炎癥的刺激，會分泌相應的抑炎細胞因子，對宮頸局部的免疫反應有一定影響，能夠激活局部免疫系統(tǒng)作用。無論是病毒感染之后，或宮頸癌前病變，還是宮頸腫瘤的發(fā)病，其周圍均會有炎性介質的浸潤，局部免疫系統(tǒng)功能受到抑制，炎癥浸潤能夠體現(xiàn)其程度，也會使疾病進展，因此，改善宮頸周圍炎性浸潤，可能對宮頸HR-HPV感染的治療有益。

隨著宮頸組織的損傷程度增加，炎癥浸潤增加，促炎因子大量表達，抑炎因子表達受到抑制。持續(xù)性的宮頸HR-HPV病毒感染導致宮頸疾病的惡變，發(fā)展成宮頸癌，這一點不容忽視。陰道微生態(tài)環(huán)境的平衡，有賴于寄居在陰道四周的側壁黏膜中各種微生物之間的平衡關系，它們相互作用，共同構成防御屏障生物膜。對于宮頸疾病免疫防治的關鍵問題主要在于如何誘發(fā)有效的宮頸HR-HPV特異性免疫防御，從而使宮頸病變逆轉。本實驗中，紫柏凝膠作用宮頸癌細胞后，能夠抑制病毒繁殖，減輕局部炎癥，與臨床上使用紫柏凝膠能夠有效降低HR-HPV的病毒載量相符[2]。紫柏凝膠能夠通過改善宮頸局部免疫功能，抑制局部炎癥反應，有利于抑制HR-HPV，但需要有相關疾病實驗進一步明確本方對HR-HPV病毒的作用機制。

參考文獻：

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（收稿日期：2014-11-08；編輯：華強）