陸鋮 周盛會 李煒 鄭修麗 高慶劍 湯浩

摘要：目的 采用高效液相色譜法建立同時測定黃芪生脈飲中五味子乙素、五味子酯甲、黨參炔苷和魯斯可皂苷元含量的方法。方法 色譜柱：Agilent Eclipse C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈-0.1%冰醋酸水溶液，梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm。結(jié)果 五味子乙素、五味子酯甲、黨參炔苷和魯斯可皂苷元的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，線性范圍分別為0.862 5～21.562 5 μg（r2=0.999 1）、0.737 5～18.437 5 μg（r2=0.999 4）、0.095 2～2.380 0 μg（r2=0.999 6）、0.810 0～20.250 0 μg（r2=0.999 0），平均回收率分別為98.06%、99.61%、97.98%、99.30%，RSD分別為1.64%、2.72%、1.45%、1.25%。結(jié)論 該法準(zhǔn)確可靠、快速、專屬性強、結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好。

關(guān)鍵詞：黃芪生脈飲；五味子乙素；五味子酯甲；黨參炔苷；魯斯可皂苷元；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.027

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）07-0096-04

Simultaneous Determination of Four Components in Huangqi Shengmai Decoction by HPLC-DAD LU Cheng1，2， ZHOU Sheng-hui1，2， LI Wei2， ZHENG Xiu-li2， GAO Qing-jian1，2， TANG Hao2 （1.School of Pharmacy， Ningxia Medical University， Yinchuan 750000， China；2.Gansu Provincial Hospital， Lanzhou 730000， China）

Abstract：Objective To establish a method for simultaneous determination of contents of schisandrin B， schisantherin A， lobetyolin and ruscogenin in Huangqi Shengmai Decoction with HPLC method. Methods The chromatographic column was an Agilent Eclipse C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） that was maintained at a constant temperature of 30 ℃. The mobile phase was 0.1% acetic acid solution-acetonitrile， with gradient elution. The flow rate was 1.0 mL/min. The detection was at wavelength of 280 nm. Results The standard curves of schisandrin B， schisantherin A， lobetyolin and ruscogenin had good linearity in the ranges of 0.862 5-21.562 5 μg （r2=0.999 1）， 0.737 5-18.437 5μg （r2=0.999 4）， 0.095 2-2.380 0 μg （r2=0.999 6）， and 0.810 0- 20.250 0 μg （r2=0.999 0）， respectively. The average recoveries of the four components were 98.06% （RSD=1.64%）， 99.61% （RSD=2.72%）， 97.98% （RSD=1.45%）， and 99.30% （RSD=1.25%）， respectively. Conclusion This method is accurate， rapid and specific， achieving the stable results with high reproducibility.

Key words：Huangqi Shengmai Decoction；schisandrin B；schisantherin A；lobetyolin；ruscogenin；HPLC

黃芪生脈飲由黃芪、黨參、麥冬、五味子、南五味子5味藥組成，是由古方生脈散演變而來。生脈散處方源自張元素《醫(yī)學(xué)啟源》，具有益氣滋陰、養(yǎng)心補肺功效[1]。目前已有大量關(guān)于黃芪生脈飲臨床應(yīng)用的文獻(xiàn)報道[2-3]。2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）[4]記載，黃芪甲苷、五味子乙素、五味子酯甲、黨參炔苷、魯斯可皂苷元分別是黃芪、五味子、南五味

通訊作者：湯浩，E-mail：gsyy_th@sina.cn

子、黨參和麥冬的主要有效成分。

目前，關(guān)于黃芪生脈飲中有效成分的測定多集中于黃芪甲苷[5-6]，尚未見對黃芪生脈飲中其余有效成分同時進(jìn)行定量分析的文獻(xiàn)報道?！吨腥A人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第十六冊）》僅有對黃芪生脈飲相對密度的測定，而無對該制劑有效成分的定量測定項[7]。因此，本試驗采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定黃芪生脈飲中五味子乙素、五味子酯甲、黨參炔苷和魯斯可皂苷元的含量，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善及醫(yī)院中成藥制劑引進(jìn)的質(zhì)量測評提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀，包括G1312A二元梯度泵、G1313A自動進(jìn)樣系統(tǒng)、G1315B二極管陣列檢測器（DAD）及Agilent LC 3D Rev A.10.02色譜工作站；AB204-N電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SK3300LHC超聲清洗儀，上?？茖?dǎo)有限公司； D-37520型臺式高速低溫離心機，德國Heraeus公司。

對照品五味子乙素（批號110765-201311）、五味子酯甲（批號111529-200604）、黨參炔苷（批號111732-201206）、魯斯可皂苷元（批號111909- 201204），中國食品藥品檢定研究院；黃芪生脈飲（浙江新光藥業(yè)有限公司，批號130802、130815、130824、130904、141024），購自蘭州市眾友大藥房；甲醇（色譜純，批號20140306），天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙腈（色譜純，批號20140510），天津市大茂化學(xué)試劑廠；冰醋酸（分析純，批號20030419），天津市泰興試劑廠；乙醚（分析純，批號110105），天津市富宇精細(xì)化工有限公司；乙酸乙酯（分析純，批號910104），天津市化學(xué)試劑二廠；水為三蒸水，實驗室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取五味子乙素、五味子酯甲、黨參炔苷、魯斯可皂苷元對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成每1 mL含五味子乙素862.50 μg、五味子酯甲737.50 μg、黨參炔苷95.20 μg、魯斯可皂苷元810.00 μg的混合對照品溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

精密量取黃芪生脈飲樣品0.5 mL，加乙醚2 mL、乙酸乙酯2 mL，13 000 r/min離心10 min，取上清液，置于5 mL容量瓶中，加熱蒸干，加甲醇定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 陰性對照溶液的制備

按供試品的處方和制法，分別制成不含五味子、南五味子、黨參、麥冬的陰性樣品，按“2.2”項下方法制備，即得。

2.4 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse C18柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流動相：乙腈-0.1%冰醋酸水溶液，梯度洗脫條件見表1；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：10 μL。對照品及樣品色譜圖見圖1。

表1 流動相梯度洗脫程序

時間 乙腈（%） 0.1%冰醋酸水溶液（%）

0 min 5 95

5 min 7 93

10 min 10 90

20 min 25 75

50 min 60 40

A

B

C

注：A.供試品；B.混合對照品；C.陰性對照；

1.黨參炔苷；2.魯斯可皂苷元；3.五味子乙素；4.五味子酯甲

圖1 黃芪生脈飲中4種成分HPLC圖

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對照品溶液1、5、10、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積積分值，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對照品溶液進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，見表2。結(jié)果表明，五味子乙素在0.862 5～21.562 5 μg、五味子酯甲在0.737 5～18.437 5 μg、黨參炔苷在0.092 5～2.380 0 μg、魯斯可皂苷元0.810 0～20.250 0 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表2 黃芪生脈飲4種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

成分 回歸方程 r2 線性范圍（μg）

五味子乙素 Y=1578.80X-4086.2 0.999 1 0.862 5～21.562 5

五味子酯甲 Y=1152.70X-3415.8 0.999 4 0.737 5～18.437 5

黨參炔苷 Y=488.59X-82.370 0.999 6 0.095 2～2.380 0

魯斯可皂苷元 Y=1172.70X-4007.9 0.999 0 0.810 0～20.250 0

2.6 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，在“2.4”項色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積積分值。結(jié)果五味子乙素RSD=1.23%、五味子酯甲RSD=1.29%、黨參炔苷RSD=1.87%、魯斯可皂苷元RSD=1.20%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一樣品（批號130815），按“2.2”項下方法制得供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h測定。結(jié)果顯示，供試品溶液中五味子乙素、五味子酯甲、黨參炔苷、魯斯可皂苷元的峰面積RSD分別為1.35%、1.78%、1.46%、1.13%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗

取同一樣品（批號130815）5份，按“2.2”項下方法制得供試品溶液，在“2.4”項色譜條件下進(jìn)行測定。結(jié)果樣品中五味子乙素、五味子酯甲、黨參炔苷、魯斯可皂苷元（n=5）的RSD分別為1.09%、1.78%、1.63%、1.14%。

2.9 加樣回收率試驗

精密量取2 mL已知含量的五味子乙素、五味子酯甲、黨參炔苷、魯斯可皂苷元樣品（批號130815）6份，分別精密加入1 mL不同濃度五味子乙素（215.6、431.3、862.5 μg/mL）、五味子酯甲（184.4、368.8、737.5 μg/mL）、黨參炔苷（23.8、47.5、95.2 μg/mL）、魯斯可皂苷元（101.3、202.5、405.5 μg/mL）對照品溶液，按“2.2”項下方法制備，依法測定，結(jié)果見表3。

表3 黃芪生脈飲中4種成分加樣回收率試驗

成分 原有量

（μg） 加入量

（μg） 測得量

（μg） 回收率

（%） 平均回

收率（%） RSD

（%）

五味子乙素 505.0 215.6 718.9 99.76

505.0 215.6 719.9 99.90

505.0 431.3 898.3 95.94 98.06 1.64

505.0 431.3 904.5 96.61

505.0 862.5 1342.4 98.16

505.0 862.5 1339.7 97.96

五味子酯甲 425.6 184.4 593.7 97.33

425.6 184.4 591.5 96.97

425.6 368.8 787.1 99.09 99.61 2.72

425.6 368.8 781.4 98.37

425.6 737.5 1191.7 102.46

425.6 737.5 1203.9 103.43

黨參炔苷 143.7 23.8 165.9 99.04

143.7 23.8 164.0 97.91

143.7 47.5 189.9 99.31 97.98 1.45

143.7 47.5 189.3 98.97

143.7 95.2 231.5 96.90

143.7 95.2 228.7 95.73

魯斯可皂苷元 811.8 101.3 912.5 99.93

811.8 101.3 911.2 99.79

811.8 202.5 982.4 96.85 99.30 1.25

811.8 202.5 1011.9 99.76

811.8 405.0 1207.6 99.24

811.8 405.0 1219.7 100.24

2.10 樣品含量測定

取5批黃芪生脈飲，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，測得峰面積積分值，計算黃芪生脈飲中五味子乙素、五味子醇甲、黨參炔苷、魯斯可皂苷元的質(zhì)量濃度，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果（n=5）

批號 五味子乙素 五味子酯甲 黨參炔苷 魯斯可皂苷元

含量（μg/mL） RSD（%） 含量（μg/mL） RSD（%） 含量（μg/mL） RSD（%） 含量（μg/mL） RSD（%）

130802 256.7 1.10 218.6 1.81 71.8 1.86 405.9 1.15

130815 253.4 1.04 211.7 1.52 71.3 1.29 408.7 1.09

130824 249.3 1.43 209.1 1.19 69.9 1.42 406.2 1.29

130904 250.9 1.27 214.7 1.07 71.1 2.03 403.0 1.83

141024 252.2 1.09 212.8 1.11 73.1 1.23 411.7 1.01

3 討論

本試驗采用HPLC同時測定黃芪生脈飲中五味子乙素、五味子酯甲、黨參炔苷、魯斯可皂苷元，方法簡便可靠、靈敏性高、專屬性強，可為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

本試驗分別考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%冰醋酸水溶液、甲醇-0.1%冰醋酸水溶液作為流動相體系，以各待測物基線分離、分離度>1.5為優(yōu)；同時對乙腈、乙醚、乙酸乙酯、乙腈-乙醚、乙腈-乙酸乙酯、乙醚-乙酸乙酯的樣本富集溶劑體系進(jìn)行優(yōu)化，測定不同方案下所選指標(biāo)待測物含量，以所選指標(biāo)成分測定含量最高為優(yōu)。最終確定流動相系統(tǒng)為乙腈- 0.1%冰醋酸水溶液，供試品制備溶劑系統(tǒng)為乙醚-乙酸乙酯（1∶1）。

魯斯可皂苷元為麥冬主要有效成分，但關(guān)于魯斯可皂苷元的含量測定方法多集中于毛細(xì)管電泳法[8-9]，采用HPLC對其進(jìn)行含量測定的報道相對缺乏。本試驗所建立的色譜方法可為麥冬中主要成分魯斯可皂苷元的HPLC含量測定提供簡單、有效的檢測手段。

參考文獻(xiàn)：

[1] 田更存，王愛香.生脈散的制劑、藥理與臨床應(yīng)用[J].中成藥，2000， 22（2）：162-165.

[2] 陳向東，陳建良.黃芪生脈飲聯(lián)合倍他樂克治療慢性心力衰竭臨床觀察[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2015，53（1）：25-27，31.

[3] Liu ZL， Liu ZJ， Liu JP， et al. Herbal medicines for viral myocarditis[J]. Cochrane Database Syst Rev，2010，7：1-68.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：61，145-146，227-228，264-265.

[5] Wu FF， Sun H， Wei WF， et al. Rapid and global detection and characterization of the constituents in Sheng Mai San by ultra-performance liquid chromatography-high-definition mass spectrometry[J]. Journal of Separation Science，2011，34：3194- 3199.

[6] Wang YH， Qiu C， Wang DW， et al. Identification of multiple constituents in the traditional Chinese medicine formula Sheng-Mai San and rat plasma after oral administration by HPLC-DAD-MS/MS[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2011，54：1110-1127.

[7] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑 第十六冊[M].1995：160.

[8] 陳乃東，陳瓊，何健.高效毛細(xì)管電泳法拆分25R、25S魯斯可皂苷元初步研究[J].藥物分析雜志，2014，34（5）：805-812.

[9] 黃寶美，姚程煒，邊清泉，等.非水毛細(xì)管電泳法同時測定麥冬中薯蕷皂苷元和魯斯可皂苷元的含量[J].藥學(xué)學(xué)報，2011，46（4）：443-446.

（收稿日期：2015-01-30）

（修回日期：2015-03-07；編輯：陳靜）