趙國華　方雅恒　陳貴

摘要 [目的] 探討發(fā)酵床養(yǎng)豬模式下不同使用年限微生物群落的變化以及不同使用時間、不同深度的發(fā)酵床墊料中墊料組分的變化。[方法] 采用常規(guī)分析方法測定樣品中的營養(yǎng)成分含量，對不同年限樣品中微生物分離提純后，結(jié)合16S rRNA分子生物學鑒定對其微生物群落進行分析。[結(jié)果] 隨著發(fā)酵床使用時間的延長，墊料中的總氮、總磷、鉀、鈣、粗灰分和粗蛋白含量均顯著增加，而水分含量降低不明顯；使用1年和2年的墊料從上層到下層總氮、總磷、總鉀和鈣的濃度逐漸降低，不同使用時間、不同深度發(fā)酵床墊料中糞尿組水分、總氮、總磷、鉀、鈣、粗灰分、粗蛋白均高于其他組。隨著使用年限的增加，豬生物發(fā)酵床墊料中微生物群落的多樣性有降低的趨勢。芽孢桿菌屬細菌和梭菌屬細菌在1年期樣品和2年期樣品中都是優(yōu)勢菌，對豬生物發(fā)酵床墊料中有機質(zhì)的降解發(fā)揮著重要的作用。[結(jié)論]該研究可為墊料的資源化合理利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵床；微生物；多樣性；成分

中圖分類號：S188+.4 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）08-098-02

規(guī)?；酿B(yǎng)殖推動了我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展，但是隨之帶來的環(huán)境污染問題也越來越引起人們的重視。發(fā)酵床養(yǎng)殖作為新型養(yǎng)殖技術(shù)，自從引入我國后被大力地推廣和使用，為解決畜牧環(huán)境污染問題帶來了新途徑。發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)是基于控制畜禽糞便排放與污染的一種新型環(huán)保型養(yǎng)殖技術(shù)，將鋸末、稻殼、秸稈等材料接種土著微生物菌種，堆積發(fā)酵后用作墊料，在經(jīng)過改造的豬舍內(nèi)加入上述有機墊料制成發(fā)酵床。在發(fā)酵床上養(yǎng)豬，糞尿會被墊料吸附，微生物降解其中的有毒有害物質(zhì)，同時利用產(chǎn)生的生物熱殺滅糞便中的腸道寄生蟲卵，從而達到降低養(yǎng)殖舍內(nèi)有害氣體濃度、減少養(yǎng)殖污染排放以及提高豬的生長性能的目的[1-3]。發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)的核心是墊料中微生物群落的活動。筆者通過監(jiān)測嘉興某發(fā)酵床養(yǎng)豬場生長肥育豬舍使用1年2年的不同深度發(fā)酵床墊料中營養(yǎng)物質(zhì)成分（水、粗蛋白、粗灰分、鈣）的變化以及氮、磷、鉀含量的變化，探索墊料中這些元素的累積情況及動態(tài)變化規(guī)律，并通過對豬生物發(fā)酵床樣品進行基因組DNA提取、16S rRNA擴增、測序分析等，了解豬生物發(fā)酵床微生物的動態(tài)變化規(guī)律，以期為墊料的資源化合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 發(fā)酵床樣品均來由金鴻牧業(yè)有限公司提供。第1年和第2年的發(fā)酵床，采用對角線采樣法分別采集5個點的樣品（其中包含糞尿區(qū)）[3]，每個點分別從上至下用刀取0～15 cm（上層）、30～40 cm（中層）和60～70 cm（下層）的墊料樣品，同一深度各2.0 kg樣品混合，然后再采用四分法取500 g，備用。糞尿點各層單獨取樣各2.0 kg，單獨混勻。混合方法：將取得的每層墊料樣品混在一起，用四分法選取500 g，置于自封袋中密封，防止水分揮發(fā)，置于有冰袋的保溫盒中，貼上標簽迅速帶回實驗室備用。

1.2 墊料的測定指標及方法 水分含量測定：采集回的墊料用四分法選取500 g，先將墊料置于65 ℃烘箱烘至恒溫，用飼料粉碎機粉碎后通過40目篩，混勻樣品，裝入廣口瓶中貼上標簽保存，待進行其他各項指標測定。墊料中水分、粗蛋白和粗灰分含量的測定方法參考《土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法》[4]。全氮和全磷含量分別采用半微量凱氏定氮法和鉬黃顯色光度法測定；全鉀含量采用原子吸收分光光度法測定。

1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化鈉50.0 g、瓊脂20 g，蒸餾水溶解定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.6，于121 ℃下高壓滅菌30 min。

1.4 微生物的分離、純化及保存 試驗中分別用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基從稀釋的豬生物發(fā)酵床樣品中選擇性地分離細菌和放線菌，以供細菌16S rDNA分子生物學鑒定。

1.5 細菌16SrDNA片段的擴增 以細菌通用引物 27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，1492R：5′-TACGGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3′為引物，豬生物發(fā)酵床分離培養(yǎng)的細菌基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR 擴增反應(yīng)體系（50 μl）：25 μl 2×MightyAmp Buffer Ver.2（含Mg2+、dNTP plus），正反向引物各15 pmol，基因組DNA（直接挑菌作為基因組DNA模板），MightyAmp DNA Polymerase 1 μl。

PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸1.5 min， 30個循環(huán)；最后68 ℃延伸10 min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 μl和2 μl上樣緩沖液混勻后點樣于濃度1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，于90 V電壓下電泳30 min。電泳結(jié)束后，立即在瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)下觀察，拍照并存盤。

1.6 細菌RFLP酶切分型分析 克隆后，對陽性克隆子進行PCR擴增，然后使用限制性內(nèi)切酶對擴增產(chǎn)物酶切，酶切DNA片段進行瓊脂糖凝膠電泳，所得DNA帶型圖譜通過凝膠分析軟件進行比對，然后選取不同的操作單元，并將對應(yīng)的陽性克隆子送交測序公司測序。

1.7 Blast比對 將測序結(jié)果在核酸數(shù)據(jù)庫（GenBank）中進行Blast。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同深度發(fā)酵墊料中水分、粗蛋白和粗灰分含量的變化 由表1可知，2年間不同深度發(fā)酵床墊料中，糞尿組水分含量均顯著高于其他組。使用第1年和第2年的發(fā)酵床墊料水分含量變化差異不顯著，這可能與發(fā)酵床墊料管理得好及定期深翻墊料有關(guān)。隨著墊料深度的增加，水分含量逐漸降低。墊料中的粗灰分主要來源于墊料組分及豬不斷排泄的糞污。該試驗結(jié)果表明，隨著墊料深度的增加，墊料粗灰分含量逐漸下降，這主要是由于豬的糞尿主要集中在表層的緣故。對比第1年和第2年的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，墊料中粗灰分的濃度逐漸升高，表明粗灰分有累積作用。糞尿組各層顯著高于其他組。隨著墊料深度的增加，墊料中粗蛋白的濃度逐漸降低，這是由于糞尿中含有一定量的含氮化合物，因而墊料表層粗蛋白含量最高。隨著墊料使用時間的延長，墊料中粗蛋白的濃度逐漸升高，表明粗蛋白具有累積作用。糞尿組顯著高于其他組。

2.2 2年間不同深度發(fā)酵床墊料中總氮、總磷、總鉀和鈣含量 發(fā)酵床墊料中的總氮、總磷、總鉀和鈣含量主要來源于2個方面：一方面是墊料中的鋸末、秸稈和稻殼，另一方面是豬糞污。飼料中的營養(yǎng)成分被豬消化吸收后，排泄物主要是以糞污的形式不間斷排泄。由表2可知，墊料中總氮、總磷、總鉀和鈣的濃度隨墊料使用時間的延長逐漸升高。隨著墊料深度的增加，墊料中總氮、總磷、總鉀和鈣的濃度逐漸降低。糞尿組上、中、下層總氮、總磷、總鉀、鈣的濃度均明顯高于其他組上、中、下層。這表明豬的習性是群居，這不利于充分利用發(fā)酵床的功能特性。該試驗結(jié)果與其他研究結(jié)果一致[5-7]。

2.3 微生物總基因組DNA 將所采集到的樣品經(jīng)過前處理后，提取微生物總基因組DNA并進行純化，再進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。從圖1可以看出，微生物總基因組DNA完整、無拖尾和雜帶，能滿足后續(xù)試驗要求。

2.4 保育期不同年限樣品的16SrDNA序列比對結(jié)果 將保育1年、保育2年的樣品分別與GeneBank 進行Blastn序列比對，發(fā)現(xiàn)保育期1年的樣品微生物（相似度達99%）主要有：芽胞桿菌屬（Bacillus sp）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes sp.）、破傷風桿屬（Clostridium sp.），藤黃單胞菌屬（Luteimonas sp.）、外硫紅螺菌屬（Ectothiorhodospria sp.）、海桿菌屬（Marinobacter sp.），假單胞菌屬（Pseudomonas sp）和索氏菌屬（Thauera sp）等。保育期2年的樣品中微生物（相似度達99%）主要有：芽胞桿菌屬（Bacillus sp.）、破傷風桿屬（Clostridium sp.）、Uncultured bacterium，細桿菌屬（Microbacterium sp）、節(jié)細菌屬（Arthrobacter sp）、鏈霉菌屬（Streptomyces sp）、芽胞八疊球菌屬（Sporosarcina sp.）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas sp.）等。生物發(fā)酵床保育1年樣品中與芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）相關(guān)的克隆子數(shù)有36個，占所有克隆子數(shù)的28.57%；與破傷風桿屬（Clostridium sp.）相關(guān)的克隆子有32，占所有克隆子的35.40%，因此樣品中芽孢桿菌屬和破傷風桿屬占優(yōu)勢。生物發(fā)酵床保育2年期樣品中克隆子較多的序列歸屬于芽孢桿菌屬和破傷風桿屬有克隆子27個和23個，分別占21.60%和18.40%，在樣品中占有優(yōu)勢，為優(yōu)勢菌。

芽孢桿菌屬（Bacillus）和梭菌屬（Clostridium）在生物發(fā)酵床保育期樣品中發(fā)揮著重要的作用，與其他研究結(jié)果相一致[8-9]。另外，有幾個序列與已知的細菌序列沒有任何的相似性，它們在生物發(fā)酵床中的作用還需要進一步研究。

3 小結(jié)

（1）不同使用時間、不同深度發(fā)酵床墊料中，糞尿組水

分、粗灰分、粗蛋白、總氮、總磷、總鉀和鈣含量均顯著高于其他組。

（2）從豬生物發(fā)酵床樣品中分離到的16SrDNA序列可以看出，隨著發(fā)酵床使用年限的增加，發(fā)酵床內(nèi)的微生物群落也在不斷地更替演變，保育2年時微生物群落的減少，說明隨著使用年限的增加，豬生物發(fā)酵床墊料內(nèi)的微生物群落的多樣性有降低的趨勢。在保育期樣品中，芽孢桿菌屬和梭菌屬始終是獨立的的分支，對發(fā)酵床物質(zhì)代謝和能量代謝發(fā)揮著巨大的作用。

參考文獻

[1] 畢小艷，張彬.發(fā)酵床生態(tài)養(yǎng)殖模式在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用研究進展[J].中國動物保健，2010（9）：50-51.

[2] 郭彤，郭秀山，馬建民.發(fā)酵床飼養(yǎng)模式對斷奶仔豬生長性能、腹瀉、腸道菌群及畜舍環(huán)境的影響[J].中國畜牧雜志，2012（20）：56-60.

[3] 郭彤，馬建民，趙曾元，等.不同使用時間和深度的發(fā)酵床墊料成分及重金屬沉積規(guī)律的研究[J].中國畜牧雜志，2013，49（10）：51-55.

[4] 魯如坤.土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1999.

[5] 盛清凱，武英，趙紅波，等.發(fā)酵床養(yǎng)殖墊料組分的變化規(guī)律[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2010，23（5）：1703-1705.

[6] 趙興征，劉寶慶，葛成冉，等. 生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料中營養(yǎng)成分及重金屬含量的測定[J].貴州農(nóng)業(yè)科學 2013（11）：129-131.

[7] 應(yīng)三成，呂學斌，何志平，等.不同使用時間和類型生豬發(fā)酵床墊料成份比較研究[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2010，23（4）：120-123.

[8] 朱雙紅.豬生物發(fā)酵床墊料中細菌群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2012.

[9] 張學峰，周賢文，陳群，等.不同深度墊料對養(yǎng)豬土著微生物發(fā)酵床穩(wěn)定期微生物菌群的影響[J].中國獸醫(yī)學報，2013，33（9）：1458-1462.