高偉偉 霍香如 李桂霞 韋永可 朱杰

摘 要：研究不同溫度和時間條件處理對雞爪筋膠原纖維超微結(jié)構(gòu)的影響。加熱組將新鮮雞爪筋剪碎勻漿后分別在50、60、70℃條件下水浴加熱10、20、30min；凍藏組將新鮮雞爪筋分別在-20、-80℃條件下凍藏5、10、15d，通過對處理后的樣品采用原子力顯微鏡掃描成像的方法研究雞爪筋在不同溫度及時間處理后的膠原纖維周期長度和粗糙度的變化。結(jié)果表明：膠原纖維周期隨加熱溫度升高、加熱時間增長而變短，隨凍藏溫度降低，凍藏時間的延長而變長，其中60、-20℃變化最典型。60℃時，當加熱時間由10min增至30min，周期長度由（72.20±2.58）nm減至（71.00±1.78）nm；-20℃時，當凍藏時長由5d增至15d，周期長度由（69.70±2.60）nm增至（73.00±2.90）nm。凍藏時間增加，雞爪筋膠原纖維表面的粗糙度增加；加熱時間增加，50℃加熱時，雞爪筋膠原纖維的粗糙度先增后減；60℃加熱與之相反。

關(guān)鍵詞：原子力顯微鏡；加熱；凍藏；雞爪；膠原纖維；超微結(jié)構(gòu)

Effects of Heating and Frozen Storage on Ultrastructure of Collagen Fibers from Chicken Claw

GAO Weiwei1， HUO Xiangru1， LI Guixia1， WEI Yongke1， ZHU Jie1，2，*

（1. Laboratory of Biomechanics and Engineering， Institute of Biophysics， College of Science， Northwest A&F University， Yangling 712100， China；2. Sino-US Joint Center of Food Safety， Northwest A&F University， Yangling， 712100， China）

Abstract： The main objective of this study was to explore the effects of different temperatures and treatment times on ultrastructure of collagen fibers from chicken claw. In the heated group， fresh samples were heated in water of 50， 60 and70 for 10， 20 and 30 minutes respectively； in the frozen group， samples were frozen in ?20 and ?80 ℃ for 5，10 and 15 days respectively. By scanning the samples via atomic force microscopes， the experiment was intended to examine the changes in D-spacing length and roughness of collagen fiber under different treatments. The results show that with the heating temperature rising and processing time becoming longer， the D-spacing length of collagen fiber grew shorter， and it grew longer when the frozen temperature decreased and storage time was extended. Samples at 60 and ?20 ℃ showed the most significant changes. At 60 ℃， D-spacing length reduced from72.20 to 71.00 nm （n =10） with processing time increasing from 10 to 30 min； at ?20 ℃， it increased from 69.70 to 73.00 nm （n =10） as storage time increased from 5 to 15 days.With the frozen time increasing， the surface roughness of collagen fibers from chicken claw increased. At 50 ℃， with the heating time increasing， the roughness increase firstly and then decrease. The contrary changes in roughness change were observed for heating at 60 ℃.

Key words：atomic force microscope； heating； frozen storage； chicken claw； collagen fiber； ultrastructure

中圖分類號：TS251.5 文獻標志碼：A 文章編號：

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201508001

雞爪是肉雞宰殺后的一種副產(chǎn)品，近年來以雞爪為原材料開發(fā)的產(chǎn)品深受歡迎，如鹵雞爪、炸雞爪、泡雞爪等[1]。熱處理是一種常見的肉制品熟化和殺菌方法，不同熱處理方式和溫度對雞爪品質(zhì)有顯著的影響[2]。肉在加熱過程中發(fā)生了大量的物理和生化反應(yīng)，諸多品質(zhì)也隨之變化顯著[3]，其中膠原蛋白的變化尤為重要。加熱過程中蛋白質(zhì)的熱變性是引起膠原蛋白構(gòu)造變化的主要原因[4]。

由于雞爪是富含膠原的食品，因此具有較高的營養(yǎng)價值和較好的口感。但雞爪在高溫下放置時間過長易變味[5]，所以需要進行凍藏保藏。低溫貯藏作為食品的主要保鮮方法[6]，廣泛應(yīng)用于各種食品的保鮮，膠原蛋白與肉的質(zhì)地口感有很大相關(guān)性，因此，研究膠原蛋白在低溫貯藏下的變化對于保證肉的質(zhì)地口感有著重要意義。經(jīng)研究，膠原蛋白在凍藏過程中會發(fā)生降解[7]，溶解性的改變會導(dǎo)致肉質(zhì)的改變。并且現(xiàn)有研究認為，提高凍藏速率和降低貯藏溫度能夠提高肉的質(zhì)量[8-9]。

無論采用哪種處理技術(shù)，往往都要通過檢測膠原纖維結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性來反映最終的處理效果。Binnig等[10]發(fā)明的原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）放大倍數(shù)（109倍）遠超以往的任何顯微鏡[11]，AFM是一種具有原子級高分辨的新型儀器[12]，既能夠?qū)崿F(xiàn)對細胞與生物大分子的納米級分辨成像，又能實現(xiàn)微觀局部力學(xué)特性的檢測，非常適合膠原纖維納米結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性的研究。

本研究通過對雞爪筋進行不同時間的加熱和凍藏處理，經(jīng)剪碎、勻漿、離心后制樣，用原子力顯微鏡掃描膠原纖維的結(jié)構(gòu)變化規(guī)律以及總體纖維形態(tài)的分布，找到溫度及作用時間對雞爪筋的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮雞爪購于楊凌高新農(nóng)業(yè)示范區(qū)康樂市場。將新鮮雞爪解剖取出其內(nèi)部筋腱，蒸餾水清洗，分割成1.5cm的小段，每一段作為一個樣品用量。

1.2 儀器與設(shè)備

Multimode-8型（Nanoscope V）原子力顯微鏡、SCANASYST-AIR型探針（探針材料為氮化硅）、微懸臂（T=650nm、L=115μm、W=25μm、f0=70kHz、k=0.4N/m）美國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

加熱組：將分割后的筋用剪刀剪碎，裝于10mL玻璃管中，在50、60、70℃條件下分別進行水浴加熱10、20、30min，將加熱后的雞爪筋腱在勻漿機下間歇勻漿直到雞爪筋腱被打散，然后用離心機在3000r/min下離心2次，每次2 min，除去部分可溶性雜質(zhì)，最后將得到的樣品加1.5mL蒸餾水混勻。用移液槍吸取20μL點樣于新鮮解理的云母片，室溫晾干后用移液槍吸取蒸餾水逐滴沖洗樣品，將沖洗過后的云母片用雙面膠粘在金屬臺上，于原子力顯微鏡下掃樣成像[13]。

凍藏組：分割好的筋腱于-20、-80℃條件下分別凍藏5、10、15d，將凍藏到期的雞爪筋腱取出后用剪刀機械剪碎，后續(xù)步驟同加熱組。

1.3.2 AFM成像[14-17]

所有測試均在原子力顯微鏡上完成。AFM采集樣品表面信息通過一端裝有該探針的微懸臂完成。當針尖與樣品接近時，此AFM可以通過ScanAsyst智能成像模式，對樣品進行圖像采集。

1.4數(shù)據(jù)處理

將原子力顯微鏡掃描得到的高度圖，使用軟件NanoScope Analysis（Version 1.10）統(tǒng)計數(shù)據(jù)[18-19]。實驗測定周期長度（D）、均方根（Rms）、Rz（在一個取樣長度內(nèi)，5個最大輪廓峰高之和與5個最大輪廓谷深之和的差值的平均值）的相關(guān)數(shù)據(jù)，并用Excel整理數(shù)據(jù)，分析結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 加熱和凍藏處理后雞爪筋膠原纖維周期變化

A.加熱溫度50 ℃；B.加熱溫度60℃；C.加熱溫度70℃；下腳標1～3.加熱時間分別為10、20、30 min。

圖1不同加熱溫度和處理時間對膠原纖維超微結(jié)構(gòu)的影響

Fig. 1 Ultrastructure of collagen fibers at different heating temperatures and processing times

由圖1可知，經(jīng)不同時間和溫度處理后的雞爪筋的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，經(jīng)AFM掃描可發(fā)現(xiàn)雞爪筋表面的膠原纖維周期結(jié)構(gòu)和粗糙度都有改變。加熱組隨著加熱時長和溫度的增加，膠原纖維的周期結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，未經(jīng)任何處理的膠原纖維周期為（72.40±2.74）nm。50℃加熱時，加熱10、20、30min后膠原纖維的周期長度分別為（72.30±1.63）、（72.20±0.83）、（71.80±1.19）nm；60℃加熱時，加熱10、20、30min后膠原纖維的周期長度分別為（72.20±2.58）、（71.70±3.46）、（71.00±1.78）nm；70℃加熱10min后，周期長度為（71.10±3.90）nm。70℃加熱20、30min，膠原纖維結(jié)構(gòu)已被嚴重破壞，整體纖維分布不再規(guī)則，已經(jīng)明膠化。

A.凍藏溫度-20℃；B.凍藏溫度-80℃；下腳標1～3.加熱時間分別為5、10、15d。

圖2 不同凍藏溫度和處理時間對膠原纖維超微結(jié)構(gòu)的影響

Fig. 2 Ultrastructure of collagen fibers at different frozen temperatures and storage times

由圖2可知，-20℃凍藏時，凍藏5、10、15d后膠原纖維的周期長度分別為（69.70±2.60）、（71.70±1.50）、（73.00±2.90）nm；-80℃凍藏時，凍藏5、10、15d后膠原纖維的周期長度分別為（69.80±2.90）、（71.40±2.40）、（72.00±1.60）nm。

圖3 加熱（A）與凍藏（B）過程中膠原纖維周期長度的變化規(guī)律

Fig. 3 Changes in D-spacing length of collagen fibers during heating （A） and freezing （B）

由圖3可知，相同加熱溫度下，加熱時間越長，膠原纖維的周期長度越短；相同加熱時間，加熱溫度越高，膠原纖維的周期長度越短。相同凍藏溫度下，凍藏時間越長，膠原纖維的周期長度越長；相同凍藏時間，凍藏溫度越低，膠原纖維周期長度越短。

2.2 加熱和凍藏處理后雞爪筋膠原纖維粗糙度變化

2.2.1 凍藏組Rz、Rms變化

圖4 凍藏組Rz（A）和Rms（B）的變化規(guī)律

Fig. 4 Changes of Rz（A） and Rms（B） among frozen groups

由圖4可知，隨著凍藏時間的不斷增加，-20℃和-80℃凍藏的雞爪筋膠原纖維的Rz、Rms值均呈現(xiàn)規(guī)律性變化。凍藏時間越長，Rz、Rms值越大。-20℃凍藏5、10、15d膠原纖維的Rz值分別為（4.28±0.72）、（5.55±0.15）、（5.64±0.30）nm；Rms值分別為（1.97±0.33）、（2.31±0.22）、（3.01±0.16）nm。-80℃凍藏5、10、15d膠原纖維的Rz值分別為（4.79±0.70）、（5.11±0.41）、（5.58±0.80）nm；Rms值分別為（2.54±0.58）、（2.66±0.44）、（2.93±0.57）nm。Rz和Rms的增加說明，隨著凍藏時間的增加，雞爪筋膠原纖維表面的粗糙度增加。

2.2.2加熱組Rz、Rms變化

圖5 加熱組Rz（A）和Rms（B）變化規(guī)律

Fig. 5 Changes in Rz（A） and Rms（B） during heating

由圖5可知，50℃和60℃加熱條件下膠原纖維的Rz、Rms值呈現(xiàn)相同變化規(guī)律。50℃加熱10、20、30min膠原纖維的Rz值分別為（1.70±0.15）、（5.58±0.27）、（4.51±0.22）nm；Rms值分別為（0.87±0.00）、（2.47±0.141）、（2.20±0.45）nm。60℃加熱10、20、30min膠原纖維的Rz值分別為（5.90±0.67）、（5.46±0.15）、（6.57±0.30）nm；Rms值分別為（2.42±0. 23）、（2.31±0.06）nm、（2.45±0.13）nm。50℃加熱時，隨著加熱時間的增加，雞爪筋膠原纖維樣品的Rz、Rms的參數(shù)值都是先上升后下降；60℃加熱時，隨著加熱時間的增加，雞爪筋膠原纖維樣品的Rz、Rms的參數(shù)值都是先下降后上升。Rz和Rms的變化趨勢說明：50℃加熱時，隨加熱時間的增加，雞爪筋膠原纖維的粗糙度先增加后減??；60℃加熱時，隨加熱時間的增加，雞爪筋膠原纖維的粗糙度先減小后增加。

3 結(jié)論

用AFM對加熱和凍藏處理后的雞爪膠原纖維進行清晰的成像，從而對不同處理條件下雞爪膠原纖維的周期長度進行了界定，并通過分析同一溫度不同時長的處理結(jié)果得知，在雞爪膠原纖維的加熱過程中，膠原纖維發(fā)生了皺縮形變致使膠原纖維的周期縮短；而在凍藏過程中，膠原纖維則發(fā)生了拉伸形變致使周期增長。該實驗已基本得出加熱與凍藏過程對雞爪膠原纖維周期長度的影響。凍藏組的Rz和Rms的變化說明，凍藏處理的時間越長，雞爪筋膠原纖維表面粗糙度增大；加熱組中50℃加熱時，隨著加熱處理的時間變長，雞爪筋膠原纖維表面粗糙度先增大后減??；60℃加熱時，隨著加熱處理時間變長，雞爪筋膠原纖維表面粗糙度先減小后增大。

AFM在數(shù)據(jù)處理上存在一定的不足，主要表現(xiàn)在樣品或空氣中的污染物質(zhì)會在探針和樣品相互作用時粘附到探針上，從而在AFM成像時對膠原纖維樣品表面形態(tài)的測量產(chǎn)生干擾[20]，影響數(shù)據(jù)的分析，使誤差增大。但相比其他傳統(tǒng)的雞爪筋膠原纖維的顯微圖片，AFM的顯微系統(tǒng)對于加熱及凍藏處理后雞爪筋膠原纖維的形變可以進行更好的量化處理，這使得此次實驗處理具有更好的直觀性。同時，AFM技術(shù)及其輔助技術(shù)分辨率在側(cè)向上可達到0.1nm，豎直方向上可達到0.01nm[21]，這也提高了此次實驗結(jié)果的可靠性，該技術(shù)為肉品質(zhì)的評測及微觀測量技術(shù)提供了極有用的方向及指導(dǎo)。

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