遲苗苗，宋娟，宋芹芹，于潔，羅小暖，張璐，王欣玲，韓俊

中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室，北京 102206

鼻病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2B誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

遲苗苗，宋娟，宋芹芹，于潔，羅小暖，張璐，王欣玲，韓俊

中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室，北京 102206

為探討鼻病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2B誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的機制，本研究構(gòu)建了鼻病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2B的真核表達載體p2B-GFP，通過轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞檢測相關(guān)標(biāo)志蛋白的變化情況。結(jié)果顯示，非結(jié)構(gòu)蛋白2B定位表達于BHK-21細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白Grp78、CHOP的表達增加，并使活化轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）的轉(zhuǎn)錄活性增加，還誘導(dǎo)BHK-21細(xì)胞發(fā)生核濃縮而凋亡，使凋亡標(biāo)志蛋白PARP發(fā)生降解而減少。結(jié)果提示，鼻病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2B可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并經(jīng)該途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

鼻病毒；非結(jié)構(gòu)蛋白2B；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；凋亡

鼻病毒（rhinovirus，RhV）是導(dǎo)致普通感冒的最重要病原體。近年來大量研究表明，RhV不僅可引起上呼吸道感染，還與細(xì)支氣管炎、肺炎、哮喘等下呼吸道疾病密切相關(guān)［1］。RhV也可與其他病毒和細(xì)菌發(fā)生共感染而加重哮喘和慢性阻塞性肺病的病情［2］。RhV進入人體后，與呼吸道上皮細(xì)胞的特異性受體即細(xì)胞間黏附因子1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1）相結(jié)合，在上皮細(xì)胞及局部淋巴組織中復(fù)制，引起細(xì)胞病變及炎癥反應(yīng)［3］。然而，RhV引發(fā)呼吸道疾病的具體機制還不十分清楚。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）作為細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)凋亡的新場所，可介導(dǎo)ER應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）反應(yīng)性凋亡途徑。正常情況下，細(xì)胞ER膜上存在需肌醇酶1（inositol-requiring enzyme 1，Ire1）、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）和活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）3種跨膜蛋白。在ERS過程中，這3種跨膜蛋白可感知ERS信號并通過寡聚化和自身磷酸化由ER膜向細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)ERS信號，引起Grp78等反應(yīng)性高表達［4］。如果損傷太嚴(yán)重，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定不能及時恢復(fù)，ERS可引起細(xì)胞凋亡［5］。鼻病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白2B具有相對分子質(zhì)量小和疏水區(qū)域程度高等特點，能整合至細(xì)胞ER［6］，引起細(xì)胞病理生理變化，在RhV的致病機制中可能發(fā)揮了重要作用。

為了解RhV非結(jié)構(gòu)蛋白2B對細(xì)胞的影響，本研究構(gòu)建了帶有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)簽的RhV16 2B真核表達載體p2B-GFP，轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。結(jié)果顯示RhV16非結(jié)構(gòu)蛋白2B定位表達于ER，誘導(dǎo)BHK-21細(xì)胞發(fā)生ERS和凋亡，為闡明非結(jié)構(gòu)蛋白2B的細(xì)胞損傷機制奠定了一定基礎(chǔ)，也為抗病毒藥物設(shè)計提供了新的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

BHK-21細(xì)胞株和RhV16由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所病毒資源中心保藏，RhV16 2B真核表達載體p2B-GFP由本室構(gòu)建和保存。胎牛血清購自美國Gibco公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗購自英國Abcam公司，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HandⅢ、感受態(tài)細(xì)胞DH5a、T4連接酶購自日本TaKaRa公司，轉(zhuǎn)染試劑X-treme GENE HP購自美國Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞用含10%胎牛血清的Eagle培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 重組質(zhì)粒p2B-GFP的蛋白免疫印跡鑒定將p2B-GFP真核表達載體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，同時設(shè)pEGFP-N1載體轉(zhuǎn)染對照組及正常細(xì)胞對照組。轉(zhuǎn)染36 h后收集細(xì)胞，裂解，以1∶1 000稀釋的GFP抗體和1∶5 000稀釋的IgG-HRP標(biāo)記鼠二抗行蛋白免疫印跡檢測，用增強化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色。

1.2.3 ATF6檢測將p2B-GFP載體和pATF6-FLuc［7］（ATF6啟動子控制的螢火蟲熒光素酶）共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，同時設(shè)pEGFP-N1載體對照組及正常細(xì)胞對照組。于轉(zhuǎn)染12、24、36和48 h用多標(biāo)記微孔板檢測儀分別檢測Fluc活性。

1.2.4 ERS標(biāo)志蛋白Grp78和CHOP的檢測將p2B-GFP真核表達載體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，同時設(shè)pEGFP-N1載體對照組及正常細(xì)胞對照組。于24、36、48 h收集細(xì)胞，裂解，以1∶1 000稀釋的Grp78抗體或CHOP抗體和1∶5 000稀釋的IgG-HRP兔二抗行蛋白免疫印跡檢測，ECL顯色。

1.2.5 DAPI染色觀察細(xì)胞核的形態(tài)方法同上，將p2B-GFP真核表達載體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞并設(shè)立對照組。24、36、48 h后，用丙酮固定10 min，含0.2%Triton X-100的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH7.4）通透5 min，4′，6-二咪基-2苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色5 min，PBS洗3次，于熒光顯微鏡下觀察并拍片記錄。

1.2.6 凋亡標(biāo)志蛋白PARP的檢測方法同上，將p2B-GFP真核表達載體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞并設(shè)立對照組，于24、36、48 h收集細(xì)胞，裂解，以1∶1 000稀釋的PARP抗體和1∶5 000稀釋的IgGHRP兔二抗行蛋白免疫印跡檢測，ECL顯色。

1.2.7 ER染色觀察RhV16在細(xì)胞內(nèi)的定位方法同上，將p2B-GFP真核表達載體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞并設(shè)立對照組。36 h時，棄上清液，PBS洗3次，加入37℃預(yù)溫育的ER-Tracker Red染色工作液，37℃共孵育1 h；PBS洗3次，丙酮固定10 min；PBS洗3次，DAPI染色5 min；PBS洗3次，PE Operetta高內(nèi)涵成像系統(tǒng)（high content system，HCS）觀察并拍片記錄。

2 結(jié)果

2.1 RhV16非結(jié)構(gòu)蛋白2B定位表達于ER

為鑒定構(gòu)建的p2B-GFP質(zhì)粒能否在細(xì)胞內(nèi)正常表達RhV16非結(jié)構(gòu)蛋白2B，將質(zhì)粒經(jīng)雙酶切并測序正確后轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36 h收集細(xì)胞，GFP抗體用于蛋白免疫印跡檢測2B融合蛋白的表達情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染p2B-GFP質(zhì)粒組細(xì)胞在約35 000處檢測到預(yù)計大小的條帶，而pEGFPN1載體轉(zhuǎn)染對照組表達的GFP蛋白在25 000左右處出現(xiàn)條帶（圖1）。結(jié)果表明，p2B-GFP質(zhì)粒能在細(xì)胞內(nèi)正常表達2B-GFP融合蛋白。

圖1 p2B-GFP質(zhì)粒的蛋白表達鑒定Fig.1 Protein identification of vector p2B-GFP

為了解RhV16非結(jié)構(gòu)蛋白2B的定位，將上述鑒定的p2B-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p2B-GFP融合蛋白分布于細(xì)胞質(zhì)，呈綠色熒光。細(xì)胞經(jīng)ER-Tracker Red染色，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)紅色。非結(jié)構(gòu)蛋白2B定位表達于ER，與ER-Tracker Red共定位而呈現(xiàn)黃色。而GFP在BHK-21細(xì)胞內(nèi)的表達方式不同于非結(jié)構(gòu)蛋白2B，大部分出現(xiàn)于細(xì)胞核（圖2）。

圖2 RhV16非結(jié)構(gòu)蛋白2B定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Fig.2 RhV16-2B localized in ER

2.2 RhV16非結(jié)構(gòu)蛋白2B誘導(dǎo)ERS

為探討RhV16非結(jié)構(gòu)蛋白2B是否誘導(dǎo)細(xì)胞ERS，將p2B-GFP載體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，用蛋白免疫印跡法檢測ERS標(biāo)志蛋白Grp78和CHOP。結(jié)果顯示，p2B-GFP轉(zhuǎn)染組Grp78蛋白和CHOP蛋白明顯增加，而pEGFP-N1載體轉(zhuǎn)染組和正常細(xì)胞對照組Grp78和CHOP蛋白表達量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于p2B-GFP轉(zhuǎn)染組。隨著轉(zhuǎn)染時間延長，Grp78和CHOP蛋白表達水平均呈上升趨勢（圖3）。結(jié)果表明，RhV16非結(jié)構(gòu)蛋白2B誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生ERS。

圖3 RhV16非結(jié)構(gòu)蛋白2B誘導(dǎo)ERS標(biāo)志蛋白Grp78、CHOP和PARP的變化Fig.3 Expressions of Grp78，CHOP and PARP induced by RhV16-2B

為進一步確認(rèn)RhV16非結(jié)構(gòu)蛋白2B是否誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生ERS，將p2B-GFP載體和pATF6-FLuc共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12、24、36和48 h后，用多標(biāo)記微孔板檢測儀分別檢測Fluc的活性。結(jié)果顯示，p2B-GFP明顯增強了ATF6啟動子控制的Fluc表達活性，并隨轉(zhuǎn)染時間延長呈逐漸增強趨勢。而pEGFP-N1載體轉(zhuǎn)染對照組及正常細(xì)胞對照組雖然隨時間延長也呈現(xiàn)一定Fluc表達活性增高的趨勢，但遠(yuǎn)低于p2B-GFP轉(zhuǎn)染組（圖4）。這一結(jié)果表明，非結(jié)構(gòu)蛋白2B能通過提高ATF6的轉(zhuǎn)錄活性而誘導(dǎo)ERS。

2.3 RhV16非結(jié)構(gòu)蛋白2B誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

為了觀察RhV16非結(jié)構(gòu)蛋白2B能否引起細(xì)胞凋亡，將BHK-21細(xì)胞傳代鋪于24孔板，轉(zhuǎn)染p2B-GFP或pEGFP-N1載體，于轉(zhuǎn)染24、36和48 h時用DAPI染色。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染24、36和48 h時，p2B-GFP轉(zhuǎn)染組與pEGFP-N1載體轉(zhuǎn)染組和正常細(xì)胞對照組相比，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的核聚集現(xiàn)象（圖5）。

圖4 非結(jié)構(gòu)蛋白2B增強ATF6基因的表達活性Fig.4 RhV16-2B increased expression of ATF6

圖5 RhV16非結(jié)構(gòu)蛋白2B誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)核濃縮Fig.5 Nuclear condensation associated with apoptosis induced by RhV16-2B

為進一步確證非結(jié)構(gòu)蛋白2B誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，用p2B-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，于24、36、48 h收集細(xì)胞，用蛋白免疫印跡法檢測PARP蛋白的表達情況。結(jié)果顯示，p2B-GFP轉(zhuǎn)染組的PARP蛋白從24 h開始降低，而pEFGP-N1載體轉(zhuǎn)染組和正常細(xì)胞對照組PARP蛋白表達量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于p2B-GFP轉(zhuǎn)染組。隨著轉(zhuǎn)染時間延長，PARP蛋白的表達水平呈明顯下降趨勢（圖3）。進一步表明RhV16非結(jié)構(gòu)蛋白2B誘導(dǎo)BHK-21細(xì)胞發(fā)生了凋亡，且隨著轉(zhuǎn)染時間延長凋亡加重。

3 討論

已有證據(jù)顯示，RhV16非結(jié)構(gòu)蛋白2B可定位于ER［6］，并造成ER聚集。RhV14也有類似表現(xiàn)，還可造成ER的Ca2＋外流［7］。以此推斷鼻病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2B可影響ER功能而引起ERS，但目前研究缺少ERS發(fā)生時相關(guān)蛋白變化的證據(jù)。因此，本研究構(gòu)建了RhV16非結(jié)構(gòu)蛋白2B片段的GFP融合表達載體，并展開相關(guān)研究。結(jié)果顯示，非結(jié)構(gòu)蛋白2B可上調(diào)細(xì)胞中的ERS標(biāo)志蛋白Grp78和CHOP的表達，ATF6的轉(zhuǎn)錄活性也增加［8］。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白2B誘導(dǎo)BHK-21細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，其凋亡標(biāo)記PARP隨非結(jié)構(gòu)蛋白2B作用時間延長而降解。有研究顯示，小RNA病毒科的柯薩奇病毒感染可上調(diào)Grp78表達，激活PERK導(dǎo)致真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）磷酸化，活化ATF6和X-盒結(jié)合蛋白1（X-box binding protein1，XBP1），最終激活CHOP、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶7（cysteinyl aspartate specific proteinase 7，caspase-7）和caspase-12，并誘發(fā)凋亡［9，10］。本研究初步驗證了同屬小RNA病毒科的鼻病毒其非結(jié)構(gòu)蛋白2B也能引起細(xì)胞類似的ERS，包括Grp78上調(diào)表達、ATF6活化表達，最終激活CHOP并誘發(fā)凋亡現(xiàn)象。但還需在多種細(xì)胞中用多種方法如免疫共沉淀等進一步驗證，并開展凋亡相關(guān)通路的研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，p2B-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，蛋白免疫印跡法檢測出2條帶，35 000左右的為目的蛋白。經(jīng)測序、挑取單克隆進行反復(fù)驗證，顯示序列正確，且未混雜pEGFP-N1質(zhì)粒，推測這可能是病毒非結(jié)構(gòu)蛋白復(fù)制的新特點。目前，本實驗室已構(gòu)建了非結(jié)構(gòu)蛋白2B的區(qū)域片段，正在開展相應(yīng)的研究工作。

［1］ van Kempen M，Bachert C，Van Cauwenberge P.An update on the pathophysiology of rhinovirus upper respiratory tract infections［J］.Rhinology，1999，37（3）：97-103.

［2］ Traves SL，Proud D.Viral-associated exacerbations of asthma and COPD［J］.Curr Opin Pharmacol，2007，7（3）：252－258.

［3］ 李軍，朱啟镕.鼻病毒的研究現(xiàn)狀［J］.中華兒科雜志，2005，43（1）：18-20.

［4］ Eizirik DL，Cardozo AK，Cnop M.The role for endoplasmic reticulum stress in diabetes mellitus［J］.Endocr Rev，2008，29（1）：42-61.

［5］ Szegezdi E，Logue SE，Gorman AM，Samali A.Mediators of endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis［J］.EMBO Rep，2006，7（9）：880-885.

［6］ Mousnier A，Swieboda D，Pinto A，Guedán A，Rogers AV，Walton R，Johnston SL，Solari R.Human rhinovirus 16 causes Golgi apparatus fragmentation without blocking protein secretion［J］.J Virol，2014，88（20）：11671-11685.

［7］ de Jong AS，de Mattia F，van Dommelen MM，Lanke K， Melchers WJ，Willems PH，van Kuppeveld FJ.Functional analysis of picornavirus 2B proteins：effects on calcium homeostasis and intracellular protein trafficking［J］.J Virol，2008，82（7）：3782－3790.

［8］ Wang Y，Shen J，Arenzana N，Tirasophon W，Kaufman RJ，Prywes R.Activation of ATF6 and an ATF6 DNA binding site by the endoplasmic reticulum stress response［J］.J Biol Chem，2000，275（35）：27013-27020.

［9］ Weithauser A，Bobbert P，Antoniak S，B?hm A，Rauch BH，Klingel K，Savvatis K，Kroemer HK，Tschope C，Stroux A，Zeichhardt H，Poller W，Mackman N，Schultheiss HP，Rauch U.Protease-activated receptor-2 regulates the innate immune response to viral infection in a coxsackievirus B3-induced myocarditis［J］.J Am Coll Cardiol，2013，62（19）：1737－1745.

［10］ Zhang HM，Ye X，Su Y，Yuan J，Liu Z，Stein DA，Yang D.Coxsackievirus B3infection activates the unfolded protein response and induces apoptosis through downregulation of p58IPK and activation of CHOP and SREBP1［J］.J Virol，2010，84（17）：8446-8459.

Endoplasmic reticulum stress induced by human rhinovirus 16 2B protein

CHI Miao-Miao，SONG Juan，SONG Qin-Qin，YU Jie，LUO Xiao-Nuan，ZHANG Lu，WANG Xin-Ling，HAN Jun
State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control，National Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China

To investigate whether the non-structural protein2B of rhinovirus 16induces endoplasmic reticulum stress（ERS）and apoptosis，BHK-21 cells were transfected with a plasmid p2B-GFP expressing rhinovirus 16 2B protein.Biomarkers of ERS and apoptosis were detected respectively.The results showed that 2B protein was localized to the ER apparatus.2B protein increased the expressions of ERS marker proteins Grp78 and CHOP and the transcriptional activity of activating transcription factor 6（ATF6）.We also found2B protein induced nuclear condensation associated with apoptosis and degradation of marker protein PARP in BHK-21 cells.In conclusion，the rhinovirus 16 2B protein induces both ERS and apoptosis.

Rhinovirus；Non-structural protein 2B；Endoplasmic reticulum stress；Apoptosis

.HAN Jun，E-mail：hanjun＿sci＠163.com

2015-02-16）

國家自然科學(xué)基金（31371397），傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室發(fā)展基金（2011SKLID104）

韓俊