張驍鵬，李炘檑，鄭波，胡曉梅

1.第三軍醫(yī)大學(xué)微生物教研室，重慶市微生物工程實(shí)驗(yàn)室，重慶400038；2.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅八營(yíng)，重慶 400038

立克次體與立克次體病的檢測(cè)與鑒定

張驍鵬1，李炘檑2，鄭波2，胡曉梅1

1.第三軍醫(yī)大學(xué)微生物教研室，重慶市微生物工程實(shí)驗(yàn)室，重慶400038；2.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅八營(yíng)，重慶 400038

立克次體是一類(lèi)嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物，已被列入生物戰(zhàn)劑名錄。立克次體病是一類(lèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的人獸共患的自然疫源性疾病。立克次體嚴(yán)格的細(xì)胞寄生性決定了立克次體病的診斷不同于傳統(tǒng)方法，需根據(jù)流行病學(xué)資料、臨床癥狀和體征及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)進(jìn)行綜合判斷，通常實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是明確診斷的主要依據(jù)。從病原體的分離和培養(yǎng)到目前的基因水平比對(duì)，立克次體的檢測(cè)技術(shù)雖發(fā)展了100多年，但人類(lèi)尚未實(shí)現(xiàn)早期快速診斷立克次體病的目標(biāo)。本文主要綜述了立克次體與立克次體病檢測(cè)與鑒定的研究進(jìn)展。

立克次體；立克次體??；檢測(cè)；鑒定

1 立克次體與立克次體病

立克次體是一類(lèi)嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物，天然寄生于多種吸血節(jié)肢動(dòng)物和昆蟲(chóng)體內(nèi)［1，2］。對(duì)人類(lèi)致病的立克次體主要包括5個(gè)屬，分別為立克次體科中的東方體屬、埃立克體屬、柯克斯體屬和立克次體屬，以及巴通體科的巴通體屬（表1）。其中立克次體屬包括2個(gè)群：斑疹傷寒群僅有普氏立克次體和斑疹傷寒立克次體2個(gè)種；而目前發(fā)現(xiàn)對(duì)人類(lèi)致病的斑點(diǎn)熱群已超過(guò)15個(gè)種，如立氏立克次體、西伯利亞立克次體、澳大利亞立克次體、康氏立克次體等，該群還不斷有新現(xiàn)立克次體導(dǎo)致人類(lèi)疾病的報(bào)道［3－5］。

表1 主要立克次體病及流行區(qū)域Tab.1 The epidemic area of main rickettsial diseases

立克次體病是一類(lèi)人獸共患的自然疫源性疾病。人體通過(guò)感染立克次體的昆蟲(chóng)叮咬或接觸其糞便而感染，多發(fā)生于熱帶與亞熱帶國(guó)家和地區(qū)，在歷史上曾嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。近年來(lái)，世界范圍內(nèi)新發(fā)及再發(fā)立克次體病逐年上升，引起人們關(guān)注［6］。立克次體病通常指由立克次體屬和東方體屬感染所引起的人類(lèi)疾病，分為斑疹傷寒、斑點(diǎn)熱和恙蟲(chóng)病［7］。

斑疹傷寒主要由斑疹傷寒群立克次體引起，包括普氏立克次體引起的流行性斑疹傷寒（或虱傳斑疹傷寒）和斑疹傷寒立克次體引起的地方性斑疹傷寒（或鼠傳斑疹傷寒）。普氏立克次體通過(guò)人類(lèi)體虱進(jìn)行傳播，體虱叮咬患者后普氏立克次體隨患者血液感染體虱消化道，在患者與他人親密接觸過(guò)程中可伴隨體虱轉(zhuǎn)移至新的宿主，叮咬人類(lèi)皮膚形成傷口，并通過(guò)糞便感染這些傷口，從而引起流行性斑疹傷寒。斑疹傷寒立克次體通過(guò)鼠蚤糞便感染人類(lèi)，造成地方性的流行性傳播。

斑點(diǎn)熱群立克次體病主要根據(jù)發(fā)現(xiàn)的地域和相應(yīng)的立克次體分群來(lái)命名，如落基山斑點(diǎn)熱、非洲蜱咬熱、昆士蘭斑疹傷寒、日本紅斑熱，以及我國(guó)流行的北亞蜱傳斑點(diǎn)熱、黑龍江蜱傳斑點(diǎn)熱、內(nèi)蒙古蜱傳斑點(diǎn)熱等，目前除極地地區(qū)外世界各地均有該群立克次體病的報(bào)道［8］。斑點(diǎn)熱群立克次體也主要通過(guò)蜱類(lèi)傳播，受環(huán)境濕度和溫度、自然植被與野生動(dòng)物、人類(lèi)活動(dòng)及殺蟲(chóng)劑應(yīng)用等因素的影響，呈現(xiàn)地域流行性特征［9］。

恙蟲(chóng)病由恙蟲(chóng)病東方體引起，通過(guò)恙螨幼蟲(chóng)傳播，主要分布于叢林地區(qū)，也稱叢林斑疹傷寒。

目前，美國(guó)已將引起流行性斑疹傷寒、落基山斑點(diǎn)熱及Q熱的立克次體列入生物戰(zhàn)劑名錄中［10，11］。這3種立克次體也是實(shí)驗(yàn)室感染的重要病原體。

2 致病機(jī)制和臨床表現(xiàn)

立克次體對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有明顯的親嗜性（其次是對(duì)單核-巨噬細(xì)胞和干細(xì)胞），通過(guò)其表面蛋白與宿主細(xì)胞相應(yīng)受體的特異性結(jié)合侵入內(nèi)皮細(xì)胞。立克次體的表面蛋白主要包括外膜蛋白A和B（OmpA／B），OmpA僅存在于斑點(diǎn)熱群立克次體，而OmpB普遍存在于立克次體屬，與宿主細(xì)胞表面受體Ku70特異性結(jié)合，募集Arp2／3復(fù)合物，在其他表面蛋白如RickA的協(xié)助下改變宿主細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白構(gòu)象，從而介導(dǎo)宿主細(xì)胞的內(nèi)吞作用，將立克次體吞入細(xì)胞。然后，立克次體憑借磷脂酶D和溶血素C迅速破壞內(nèi)體膜，在內(nèi)體與溶酶體融合前進(jìn)入胞質(zhì)，以免被溶酶體溶解。在宿主細(xì)胞內(nèi)大量增殖的同時(shí)，立克次體會(huì)引起宿主細(xì)胞產(chǎn)生大量過(guò)氧化物，導(dǎo)致細(xì)胞膜磷脂過(guò)氧化損傷，破壞細(xì)胞間的緊密連接，造成宿主細(xì)胞膜的破壞和血管內(nèi)皮通透性增高［12］。這一方面引起患者組織水腫和循環(huán)血量下降（如果發(fā)生于肺和腦組織，后果尤為嚴(yán)重），另一方面會(huì)增強(qiáng)立克次體的組織間擴(kuò)散。立克次體可隨宿主細(xì)胞破裂崩解入血，引起第1次菌血癥，隨即擴(kuò)散至全身各處血管內(nèi)皮細(xì)胞并增殖。被立克次體感染的細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子β（tumor necrosis factorβ，TNF-β）、白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）、IL-8等炎性介質(zhì)，引起機(jī)體炎癥反應(yīng)，患者出現(xiàn)發(fā)熱、乏力、頭昏頭痛等癥狀。若未加以干預(yù)治療，在患者血管內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛增殖的立克次體會(huì)再次引起血管內(nèi)皮通透性增加并釋放入血，引起第2次菌血癥，往往導(dǎo)致機(jī)體嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和彌散性血管內(nèi)凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC），病死率較高。

立克次體病的主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、皮疹、肌肉痛和頭痛。斑點(diǎn)熱群立克次體病常伴有惡心、嘔吐、腹瀉等胃腸道癥狀，恙蟲(chóng)病常伴有廣泛性的淋巴結(jié)腫大和疼痛。除斑疹傷寒群外，立克次體感染的典型癥狀為蜱或螨叮咬部位形成的焦痂樣皮損，但通常由于皮損部位隱秘且無(wú)痛，很難觀察到而被忽視。由于立克次體病的臨床表現(xiàn)一般缺乏特異性，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)通常是明確診斷的主要依據(jù)。實(shí)驗(yàn)室常用的血清學(xué)診斷要在發(fā)病后10～12 d才開(kāi)始呈陽(yáng)性，無(wú)法滿足早期診斷的需求，且由于立克次體之間存在廣泛的抗原交叉，血清學(xué)檢測(cè)只能用于分群診斷［7］。因此，發(fā)展立克次體的早期快速診斷和分型診斷的技術(shù)迫在眉睫［13］。

3 檢測(cè)與鑒定

3.1 病原學(xué)診斷

立克次體感染初期，即病原體通過(guò)節(jié)肢動(dòng)物叮咬侵入患者機(jī)體時(shí)，往往沒(méi)有明顯的疾病表現(xiàn)，患者不會(huì)就醫(yī)，很難分離到陽(yáng)性標(biāo)本，僅能從部分患者被叮咬部位形成的焦痂中通過(guò)組織活檢分離得到。當(dāng)立克次體在患者體內(nèi)大量增殖而引起明顯疾病表現(xiàn)時(shí)，可從血液樣本中分離到立克次體，由于其是胞內(nèi)寄生菌，故血液樣本中有核細(xì)胞含量越多，檢出陽(yáng)性率越大。另外，在疾病中后期出現(xiàn)的皮損中也能分離到大量立克次體。除患者外，從立克次體的中間宿主如虱、蚤等節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)，以及自然宿主如野生哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和嚙齒類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)，也可分離出大量的立克次體。

立克次體的培養(yǎng)和染色觀察是其診斷和分類(lèi)的重要方法，為研究奠定了重要基礎(chǔ)。最為經(jīng)典的常規(guī)培養(yǎng)方法為雞胚接種，也可采用細(xì)胞培養(yǎng)（如Vero細(xì)胞），但仍需借助染色觀察或其他技術(shù)手段加以診斷和鑒別［14］。吉姆薩（Giemsa）染色法、吉姆尼茨（Gimenez）染色法、直接免疫熒光法（direct immunofluorescence assay，DFA）等可用于立克次體鑒定，但在非培養(yǎng)條件下很難觀察到陽(yáng)性結(jié)果［15］。

立克次體檢查耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，對(duì)檢測(cè)人員的要求高，且存在一定的繼發(fā)感染風(fēng)險(xiǎn)，目前僅用于基礎(chǔ)研究和流行病學(xué)調(diào)查，不作為臨床檢測(cè)的主要方法。

3.2 血清學(xué)診斷

由于立克次體中部分種屬與變形桿菌有抗原交叉，可利用變形桿菌屬X19，X2.Xk菌株的菌體O抗原代替立克次體抗原，與患者血清進(jìn)行交叉凝集反應(yīng)，檢測(cè)患者血清中相應(yīng)抗體，即外斐試驗(yàn)。外斐試驗(yàn)一度是立克次體診斷最經(jīng)典的方法，成本低廉，但特異性很差，目前已逐漸被特異性較高的熒光免疫法取代，僅在經(jīng)濟(jì)條件較差的國(guó)家和地區(qū)使用。免疫熒光法利用含有立克次體外膜蛋白特異性表位的熒光探針，檢測(cè)患者體內(nèi)針對(duì)該蛋白產(chǎn)生的特異性抗體，以診斷立克次體感染。免疫熒光法包括直接法和間接法2種，其中間接熒光法（indirect fluorescence assay，IF）是目前診斷立克次體感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”?；诖嗽斫⒌拿嘎?lián)免疫法，即用酶染料代替熒光染料標(biāo)記，常用于實(shí)驗(yàn)室研究，其中免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）最常用［16］，但以上方法仍存在不能確定種屬且不能應(yīng)用于早期診斷的問(wèn)題。

3.3 聚合酶鏈反應(yīng)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析

1989年聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)的出現(xiàn)，為立克次體的診斷與分型打開(kāi)了一扇新的大門(mén)，從而進(jìn)入基因檢測(cè)的新時(shí)期。最初研究者嘗試?yán)闷胀≒CR檢測(cè)立克次體的特定序列，但特異性和敏感性均不滿意。隨后改良的套式PCR（nested PCR，nPCR）明顯提高了檢測(cè)靈敏度，但存在假陽(yáng)性率過(guò)高的問(wèn)題。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRTPCR）很好地克服了這一缺陷，還可利用熒光標(biāo)記進(jìn)行定量檢測(cè)［17］。DNA檢測(cè)縮短了立克次體診斷的窗口期，比傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)更適用于早期快速診斷，已被很多研究機(jī)構(gòu)所采用。

由于立克次體的基因組高度保守，采用單一序列進(jìn)行PCR檢測(cè)無(wú)法達(dá)到種屬分型的需求，研究者進(jìn)一步采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（restrictionfragment length polymorphism，RFLP），即通過(guò)比較被限制性內(nèi)切酶處理過(guò)的樣本基因片段長(zhǎng)度來(lái)鑒別不同立克次體及鑒定未知立克次體的種屬［18］。該法使立克次體的分型診斷首次成為現(xiàn)實(shí)，具有重要意義。但其僅通過(guò)酶切后的基因長(zhǎng)度進(jìn)行分析，仍無(wú)法為親緣性較近的立克次體分型，對(duì)其信度和效度也存在一定爭(zhēng)議。

3.4 多位點(diǎn)序列分型與全基因組比對(duì)分析

隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST或MST）成為立克次體基因診斷與分型較為可靠的新方法。2003年Fournier利用立克次體OmpA的編碼基因序列與GenBank中的已知序列比對(duì)進(jìn)行斑點(diǎn)熱群立克次體的種間鑒別［5］，并做了大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證工作［19］。隨后Fournier采用了新的算法，同時(shí)比對(duì)rrs、 gltA、ompA、ompB和sca4這5個(gè)不同基因，綜合5個(gè)位點(diǎn)的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行分型［20］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MLST大大提高了立克次體檢測(cè)的敏感性和分型的可靠性，自此立克次體的MLST法得以建立［21］，并很快在世界范圍內(nèi)被廣泛采用［22，23］。但某些樣品的MLST分析結(jié)果與目前通用的16s RNA分型結(jié)果并不完全一致，對(duì)現(xiàn)有的生物分類(lèi)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)提出了一定挑戰(zhàn)［9，24］。

隨著人類(lèi)進(jìn)入后基因組時(shí)代，全基因組測(cè)序的效率大幅度提高，越來(lái)越多的立克次體全基因組測(cè)序結(jié)果先后被報(bào)道［25］。Walker等首次對(duì)立克次體進(jìn)行全基因組水平的比對(duì)分析，比傳統(tǒng)的5基因MLST法更全面，開(kāi)啟了細(xì)菌全基因組鑒定的先河［26］。但其仍為DNA水平的比對(duì)分析，對(duì)樣本的要求也比傳統(tǒng)PCR更高（表2）。

表2 立克次體與立克次體病的檢測(cè)與鑒定方法Tab.2 Detection and identification of Rickettsiaand rickettsial diseases

4 結(jié)語(yǔ)

從病原體的培養(yǎng)觀察到較為特異的血清學(xué)診斷，再到基因水平的診斷和鑒定分型，人類(lèi)在立克次體的診斷與分型道路上不斷探索和前進(jìn)。立克次體作為一種重要的生物戰(zhàn)劑，對(duì)其進(jìn)行深度的流行病學(xué)研究和病原學(xué)分析意義重大。隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，基因診斷與分型技術(shù)不斷提高，高通量的芯片和測(cè)序技術(shù)也不斷發(fā)展和完善，實(shí)現(xiàn)立克次體與立克次體病的早期快速檢測(cè)與鑒定指日可待。

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Detection and identification of Rickettsiaand rickettsial diseases

ZHANG Xiao-Peng1，LI Xin-Lei2，ZHENG Bo2，HU Xiao-Mei1
1.Department of Microbiology，College of Basic Medical Sciences，The Third Military Medical University，Chongqing 400038，China；2.Eighth Battalion，Cadet Brigade，The Third Military Medical University，Chongqing 400038，China

Rickettsia is an obligate intracellular parasitic bacterium which has been included in the list of biowarfare agents.Rickettsial diseases are zoonotic，natural focal diseases，and also threats to human health seriously.Different from the standard detection methods for other bacteria，the diagnosis of rickettsial diseases needs a collective consideration of the epidemiological data，clinical symptoms and laboratory test results.Although Rickettsia detection technology has been developed for more than 100 years，early rapid diagnosis is still difficult.Current progresses on Rickettsia and rickettsial disease detection，including pathogen isolation and molecular detections，are reviewed in this paper.

Rickettsia；Rickettsial disease；Detection；Identification

.HU Xiao-Mei，E-mail：hxmay2008＠163.com

2014－12－09）

全軍“十二五”重大科研項(xiàng)目（AWS11C001）

胡曉梅