郭志成，殷 亮，王曉慧

(上海體育學院運動科學學院，上海 200438)

過度訓練不僅降低運動能力，還可能使運動員出現(xiàn)運動性免疫抑制、呼吸道感染，而不得不停止訓練和比賽，因此及時發(fā)現(xiàn)過度訓練是體育界非常重要的問題。目前，除了運動員的主觀感覺外，多應用七大類生理指標(血睪酮水平、皮質(zhì)醇水平，睪酮/皮質(zhì)醇比值，晨脈，Hb水平，血尿素、血清肌酸激酶)的綜合評定來判斷運動員是否出現(xiàn)過度訓練，但這些指標均沒有特異性，且個體之間的差異較大。因此，迫切需要有簡便的評價方法和靈敏、特異的過度訓練監(jiān)控指標。

近年來的研究顯示，血漿游離DNA(cell free DNA，cfDNA)的水平很可能是一個很好的候選分子［1］。cfDNA是指血漿或血清中未與細胞結(jié)合的雙鏈DNA片段，大多數(shù)cfDNA是斷裂的雙鏈DNA，正常人血漿cfDNA很少［2］。1982年首次報道了運動通過增多的自由基損傷組織，引起DNA斷裂，使血中出現(xiàn)較多的cfDNA［3］。近幾年來關(guān)于運動對血漿cfDNA的影響及意義越來越受到研究者的關(guān)注。已發(fā)現(xiàn)多種運動方式，如馬拉松［4-6］、舉重［7］等力竭運動會使血漿cfDNA增加。且血中cfDNA的水平與過度運動所致的無菌性炎癥的嚴重程度［7，8］或運動強度［9］成正比。血漿cfDNA被認為是現(xiàn)在最有希望成為反映過度訓練的指標［10］。

檢測血漿cfDNA的方法有血漿DNA的熒光定量測定［4，11］和定量 PCR 方法［6，8，12，13］。前者敏感性較低，且必須要抽提血漿DNA才行;而定量PCR的方法敏感性高，穩(wěn)定性好，有部分研究不抽提血漿DNA、直接進行PCR擴增，且能反映總的DNA損傷程度，是現(xiàn)在最常用的方法。但是，目前檢測血漿cfDNA的定量PCR方法幾乎都是關(guān)于人體的檢測，缺乏針對大、小鼠的檢測。本文旨在建立適用于檢測大鼠血漿cfDNA的定量PCR方法，并探討cfDNA能否成為大鼠過度訓練的新監(jiān)控指標。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

2月齡健康雄性SD大鼠12只隨機分為2組(n=6):安靜組和過度訓練組，自由攝食和飲水，每周檢測大鼠體重。

1.2 大鼠的訓練方案

過度訓練組大鼠經(jīng)3 d的跑臺適應性運動后，按課題組的運動方案進行5周的遞增負荷運動［14］，每周運動6 d，休息1 d。具體運動方案為第一周:坡度5%，跑速15 m/min，持續(xù)30min;第二周:坡度不變，跑速增加到20m/min，持續(xù)45 min;第三周:坡度增加到10%，跑速為25 m/min，持續(xù)45 min;第四周:坡度增加到15%，跑速30m/min，持續(xù)60min;第五周:坡度15%，跑速為32 m/min，持續(xù)60min。第5周的最后一天運動至力竭，力竭判斷標準為連續(xù)給予大鼠電刺激，大鼠不繼續(xù)跑動，停跑后呼吸急促、神情倦怠，腹臥位，捕捉時逃避反應明顯減弱。安靜組大鼠不做跑臺運動。

1.3 大鼠血漿游離DNA水平的檢測方法的建立

1.3.1 保守基因的選擇和引物的設計 由于cfDNA可能是全長的、更可能是被隨機剪切的雙鏈DNA，為提高cfDNA檢出的敏感性和準確性，需選擇拷貝數(shù)多的保守基因、以及特異引物擴增出合適長度的PCR產(chǎn)物。目前，定量PCR擴增cfDNA的研究大多針對人，缺乏針對大鼠cfDNA的定量PCR方法的研究，所以只能根據(jù)人的研究結(jié)果選擇大鼠的保守基因。人的cfDNA擴增中常選擇的保守基因是β-球蛋白、肌肉生長抑制素［8］和 L1PA2［13］，擴增片段的長度分別為189 bp、88 bp和雙片段(90bp和220bp)，檢測得到的正常人cfDNA為1.32～18.01 ng/L，大多在(5 ～6)ng/L［15，16］。本課題組之前的工作選擇了更為保守的人Alu基因(隨機分布在全基因組的短重復序列，全長300bp，約有50萬份拷貝，占人基因的10%左右。由于這種DNA序列中有限制性內(nèi)切核酸酶AluⅠ的識別序列，所以稱為Alu重復序列或Alu基因)，用所設計的引物能特異地擴增152 bp的片段，得到正常人cfDNA的均值為2.23 ng/L，這提示本研究所建立的定量PCR方法不僅特異，可能比以往的定量PCR方法而更敏感。所以，本文在擴增大鼠血漿cfDNA時選擇了與人Alu基因同源的，在大、小鼠基因中最保守、含量最豐富的B1重復序列。它約有5萬個拷貝，散在分布在整個基因組中。因為大、小鼠的B1基因序列基本相同，所以引物設計參考本文通訊作者在美國進修的實驗室擴增小鼠 B1 基因的引物［17］，正向引物 5’-CCA GGA CAC CAG GGC TAC AGA G-3’和反向引物5’-CCC GAG TGC TGG GAT TAA AG-3’，擴增產(chǎn)物長109 bp。

1.3.2 血漿稀釋倍數(shù)的確定檢測血漿cfDNA的定量PCR方法中大部分需先抽提血漿DNA，有一篇文獻將血漿5倍稀釋后直接進行PCR擴增。本方法中分別將血漿原液、不同稀釋倍數(shù)(稀釋5倍、10倍和20倍)的血漿進行熒光定量PCR，發(fā)現(xiàn)血漿稀釋10倍的cfDNA擴增的特異性和敏感度最好。

本研究的實時熒光定量PCR(美國ABI公司的Step One Plus)的檢測方法為:用不含DNA和RNA的去離子水10倍稀釋大鼠血漿后，取2μl加入到SYBR Green的反應體系中。該體系中包含2×Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(Thermo scientific 公司)12.5μl，25μmol/L 上下游引物各 0.3μl，不含DNA和RNA的去離子水9.9μl，總體積25μl。95°C 預變性 8 min 后，95°C 變性 30s，55°C 退火40s，72°C延伸1 min，50個循環(huán)。不同濃度的小鼠DNA標準品在同一條件下進行擴增，做出標準曲線。所有標準品和樣品都做復孔。根據(jù)溶解曲線判斷擴增產(chǎn)物的特異性，再根據(jù)擴增曲線設定基線和閾值，利用標準曲線獲得各樣本的Ct值及DNA濃度。

1.4 大鼠血漿睪酮、皮質(zhì)酮水平和T/C比值的檢測

ELISA方法檢測睪酮(testosterone，T)和皮質(zhì)酮(corticosterone，Cort)，試劑盒分別購于美國R＆D和美國CUSABIO公司，按試劑盒說明書進行操作。睪酮的值除以皮質(zhì)酮的值即為T/C比值。

1.5 大鼠血漿氧化、抗氧化指標和肌酸激酶的檢測

各指標的檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。比色法檢測大鼠血漿的氧化、抗氧化指標，包括血漿總抗氧化能力(T-AOC，U/ml)、丙二醛(MDA，nmol/ml)、超氧化物歧化酶(SOD，U/ml)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px，酶活力單位)。其中，0.1 ml血漿在37°C反應5 min使GSH濃度降低1μmol/L為GSH-Px的一個酶活力單位;比色法檢測大鼠血漿肌酸激酶(CK，U/L)水平。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠血漿cfDNA的定量PCR檢測方法的特異性

血漿稀釋10倍后用我們所建立的熒光定量PCR方法能特異地擴增大鼠B1基因，且測得的對照組大鼠血漿cfDNA為(2.46±2.43)ng/L。圖1顯示用本文建立的定量PCR方法擴增過度訓練和安靜組大鼠的各血漿樣本cfDNA和標準品的擴增曲線和溶解曲線，可見擴增產(chǎn)物的特異性較好。

Fig.1 Melt and amplification curves of real time PCR for detecting plasma cfDNA of rats

2.2 過度訓練對大鼠體重的影響

實驗前兩組大鼠的體重無顯著性差異。過度訓練組大鼠的體重從第3周起就比安靜組顯著降低，維持至實驗結(jié)束。而且，從第4周起過度訓練組大鼠的體重就不增加(P＜0.05，P＜0.01)，到第5周時體重降低(P＜0.05，表1)。

2.3 過度訓練對大鼠血漿睪酮、皮質(zhì)酮、T/C比值和CK的影響

與安靜組大鼠相比，過度訓練組大鼠的血漿睪酮、T/C比值顯著降低，血漿皮質(zhì)酮和CK顯著升高(P ＜0.01，表2)。

Tab.1 Changes of body weights of overtraining rats(g，，n=6)

Tab.1 Changes of body weights of overtraining rats(g，，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sedentary control;#P ＜0.05 vs overtraining of 4th week

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Tab.2 Changes of plasma levels of T，Cort，T/C ratio and CK of overtraining rats(，n=6)

Tab.2 Changes of plasma levels of T，Cort，T/C ratio and CK of overtraining rats(，n=6)

T:Testosterone;Cort:Corticosterone;T/C ratio:Testosterone/corticosterone ratio;CK:Creatine kinase＊＊P ＜ 0.01 vs sedentary control

?

2.4 過度訓練對大鼠血漿cfDNA和T-AOC、MDA、SOD、GSH-Px的影響

與安靜組相比，過度訓練組大鼠的血漿cfDNA顯著增加(約為安靜組的5.43倍，P＜0.01)、T-AOC顯著下降(P＜0.01)、MDA顯著升高(P＜0.05)、SOD和GSH-Px的活性無顯著變化(P＜0.05，P＜0.01，表3)。這說明過度訓練組大鼠的cfDNA顯著增加、氧化應激增強和抗氧化能力顯著降低。

2.5 兩組大鼠血漿cfDNA與其他指標的相關(guān)性

血漿cfDNA與血漿睪酮、皮質(zhì)酮、T/C比值、MDA的偏相關(guān)系數(shù)分別為-0.729，0.854，-0.655和0.72(P＜0.05，表4)。血漿 cfDNA 與 T-AOC、GSHPx、SOD和CK的偏相關(guān)系數(shù)沒有統(tǒng)計學意義。這說明血漿cfDNA可能是過度訓練的新監(jiān)控指標，且cfDNA的增加可能與過度訓練所致的氧化應激增強有關(guān)，可能與骨骼肌損傷關(guān)系不大。

Tab.3 Changes of plasma levels of cfDNA，T-AOC，MDA，SOD and GSH-Px of overtraining rats(，n=6)

Tab.3 Changes of plasma levels of cfDNA，T-AOC，MDA，SOD and GSH-Px of overtraining rats(，n=6)

cfDNA:Cell free DNA;T-AOC:Total antioxidant capacity;MDA:Malonaldehyde;SOD:Superoxide dismutase;GSH-Px:Glutathione peroxidase*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sedentary control

Group cfDNA(ng/L) T-AOC(U/ml) MDA(nmol/ml) SOD(U/ml) GSH-Px(U)Sedentary control 2.46±2.43 1.94±0.12 3.50±0.35 65.39±9.78 1966.67±65.73 Overtraining 13.35±6.81＊＊ 1.20±0.08＊＊ 4.09±0.43*62.42±7.48 1833.33±400.43

Tab.4 Correlation of plasma cfDNA with T，Cort，T/C ratio and CK as well as MDA，T-AOC，SOD and GSH-Px

3 討論

如前所述，由于 目前定量PCR擴增cfDNA的研究大多針對人，缺乏大、小鼠cfDNA的定量PCR方法的研究，所以沒有辦法比較不同方法間的優(yōu)劣，但這同時也意味著本方法的創(chuàng)新性明顯。本方法的優(yōu)點是只需很少的血(一滴血，約20μl，可指尖采血)、將血漿稀釋10倍、無需進行血漿DNA抽提就可直接進行PCR擴增，3 h左右即可獲得結(jié)果，即本文建立了一種簡便、快速、需血量很少的檢測大鼠血漿cfDNA的熒光定量PCR方法，實用性強，且該方法和引物也適用于小鼠血漿cfDNA的檢測(因為大、小鼠的B1基因序列基本相同)。

為明確大鼠血漿cfDNA是否是過度訓練的新監(jiān)控指標，本研究不僅用本文所建立的定量PCR方法檢測過度訓練大鼠的血漿cfDNA，還檢測了反映過度訓練的多個生理生化指標。目前認為當出現(xiàn)下列8個變化中的多個時提示有過度訓練，包括(1)體重下降，特別是體重下降超過1/30時;(2)運動能力的下降;(3)血睪酮下降40%以上;(4)T/C比值下降30%以上;(5)血清CK次日晨升高50%以上;(6)Hb水平下降;(7)血尿素升高［18］;(8)晨脈增加等。本實驗中過度訓練組大鼠的體重在第4周起就不增加，第5周降低(對照組大鼠體重持續(xù)增長);且過度訓練大鼠的運動能力下降，在造模后期的運動過程中大鼠需休息數(shù)次才能完成訓練;運動后36 h過度訓練大鼠的血T水平下降約70%、T/C比值下降約90%，血清CK升高63%左右，以上結(jié)果表明過度訓練組大鼠確實出現(xiàn)了過度訓練。這些過度訓練大鼠的血漿cfDNA比安靜組的顯著增加，約是安靜組的5.43倍。進一步將血漿cfDNA和反映過度訓練的生理指標進行了偏相關(guān)系數(shù)的分析，結(jié)果顯示血漿cfDNA與血漿T水平、T/C比值高度負相關(guān)，與血漿Cort水平高度正相關(guān)，提示血漿cfDNA很可能是反映過度訓練的新指標。

不論是一次的大強度過度訓練［4-7，12］(急性)，還是持續(xù)一段時間(慢性)的大強度或大負荷過度訓練［8，10］都可使血漿 cfDNA 的水平迅速(多在運動后的數(shù)分鐘到1～2 h內(nèi))升高，且增加幅度明顯;血漿cfDNA增加得越顯著，則越可能出現(xiàn)過度訓練。如果是單次的大強度過度運動則血漿cfDNA清除較快，通常在12 h 內(nèi)恢復正常［4-7，12］，而慢性的大強度和大負荷過度訓練則升高的cfDNA維持較久，從1 d到10余天不等，由運動強度和負荷決定［8，10］。血漿cfDNA在慢性過度訓練中快速、明顯的增加，以及清除較慢的特點使我們推測:若想監(jiān)測過度訓練的出現(xiàn)和恢復過程，或許可通過動態(tài)觀察血漿cfDNA在訓練后多個時間點的水平來實現(xiàn)。因此該檢測方法和血漿cfDNA在過度訓練中具有重要的應用價值。

關(guān)于過度訓練時血漿cfDNA增多的機制，最常見的解釋是氧化應激增強。大強度和大負荷的運動，特別是力竭運動過程中機體會產(chǎn)生大量自由基［19，20］，通過氧化/還原失衡，過氧化增強而導致骨骼肌DNA損傷，斷裂的DNA釋放入血即為cfDNA［9］。SOD、GSH-Px是機體抗氧化系統(tǒng)中非常重要的抗氧化酶，MDA是過氧化脂質(zhì)的代謝產(chǎn)物，其含量可反映體內(nèi)自由基代謝的情況［21］。本文發(fā)現(xiàn)過度訓練大鼠的血漿cfDNA升高的同時，血漿總抗氧化能力降低，氧化反應的產(chǎn)物MDA增加、且MDA與血漿cfDNA高度正相關(guān)，提示氧化增強可能是過度訓練大鼠血漿cfDNA增加的原因之一。除了氧化應激增強這個解釋之外，血漿cfDNA也可能來自于組織、細胞受損后損傷 DNA 的釋放入血［8，10，22］。血漿CK水平是最常用的反映骨骼肌細胞損傷及其適應與恢復的一個敏感指標，也是因為這個原因血漿CK水平也是反映是否存在過度訓練的指標之一。本研究發(fā)現(xiàn)，盡管過度訓練大鼠的血漿CK水平增加，但沒有發(fā)現(xiàn)其與血漿cfDNA的相關(guān)性，提示過度訓練大鼠血漿cfDNA的增加可能與骨骼肌的損傷關(guān)系不大。這與Fatouros IG等人的研究類似，他們發(fā)現(xiàn)盡管中等程度訓練的運動員在跑臺運動后反映骨骼肌損傷的多個指標包括血漿CK增加，但CK增加的動力學變化和cfDNA的不同，提示運動后cfDNA的釋放機制可能與肌肉損傷無關(guān)［16］。

綜上，本文成功地建立了檢測大鼠血漿cfDNA的實時熒光定量PCR方法，且研究結(jié)果表明血漿cfDNA水平可作為反映大鼠過度訓練的新監(jiān)測指標。

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